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上海酶聯(lián)生物研究所
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細(xì)胞培養(yǎng)是將器官、組織或細(xì)胞從生物機(jī)體中取出，模擬該器官、組織或細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生存、生長(zhǎng)和繁殖。一些研究結(jié)果表明，許多種類的動(dòng)物或植物的細(xì)胞都能在人工培養(yǎng)條件下生存、生長(zhǎng)和繁殖。
現(xiàn)代的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)始于美國(guó)動(dòng)物學(xué)R.G.Harrison。他于1906年在無(wú)菌條件下，以淋巴液做培養(yǎng)基，培養(yǎng)了蝌蚪的神經(jīng)板，并觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的過(guò)程。到了20世紀(jì)后半葉，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的崛起，為了在活細(xì)胞中研究生命現(xiàn)象，細(xì)胞培養(yǎng)方法得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。
細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點(diǎn)，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等的影響。因?yàn)槿斯づ囵B(yǎng)條件易于改變，并能得到嚴(yán)格的控制，有利于單因子分析。二是細(xì)胞培養(yǎng)便于我們對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程的觀察，可以用顯微鏡直接觀察亦可應(yīng)用顯微縮時(shí)電影技術(shù)記錄其進(jìn)程。因而，細(xì)胞培養(yǎng)是探索和解釋細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的一種簡(jiǎn)而易行的技術(shù)。
然而，細(xì)胞培養(yǎng)方法也有其局限性，由于培養(yǎng)的細(xì)胞生活在脫離了機(jī)體的復(fù)雜的環(huán)境條件下，其生態(tài)環(huán)境和細(xì)胞之間的相互關(guān)系都改變了，因此，其細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)必然也會(huì)發(fā)生某些改變。所以在人工培養(yǎng)條件下觀察到的結(jié)果難于正確反映細(xì)胞或組織在機(jī)體內(nèi)部的狀況。這一點(diǎn)是我們?cè)趹?yīng)用此技術(shù)進(jìn)行研究時(shí)應(yīng)該注意的。
盡管如此，由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是其他實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、老年學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了很多重大的成果。
細(xì)胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞在體外長(zhǎng)期生存，必須模擬體內(nèi)環(huán)境，共給細(xì)胞存活所必需的條件。如供給適量的水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及有關(guān)的生長(zhǎng)因子；氧氣及適宜的溫度；注意調(diào)節(jié)其外環(huán)境的酸堿度（pH）與滲透壓；以及為排除細(xì)胞代謝產(chǎn)物的危害，保持良好適宜的外環(huán)境而進(jìn)行必需的傳代等等。所有這一切條件與操作都要保持在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
一、目的與要求
通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法以及在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中嚴(yán)格的操作程序。
初步掌握無(wú)菌操作的基本原則，認(rèn)識(shí)無(wú)菌操作在細(xì)胞培養(yǎng)中的重要性。
二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、原代細(xì)胞的制作——示范
2、傳代細(xì)胞的傳代
三、實(shí)驗(yàn)步驟
（一）原代細(xì)胞的制作——以乳鼠腎細(xì)胞原代單層靜置培養(yǎng)為例，按實(shí)驗(yàn)時(shí)操作的順序進(jìn)行描述。
1.操作者首*行手的清洗與消毒，再將實(shí)驗(yàn)用品放在合適的位置，然后配置營(yíng)養(yǎng)液及調(diào)節(jié)平衡鹽液的pH值。
2. 配液
（1）乳鼠腎細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液的配置：
0．5％LH 液 90％
犢牛血清 10%
1萬(wàn)單位/ml青、* 加至約100單位/ml
7.4%NaHCO3 調(diào)pH至6.8~7.0
（2）平衡鹽液－Hank液的調(diào)節(jié)：
用7.4％NaHCO3調(diào)Hank液的pH至6.8~7.0
（3） 調(diào)*的pH值
25%*溶液中加入數(shù)滴NaHCO3,充分混勻,使其pH值為6.8~7.0。
3 .處死動(dòng)物
在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，為避免過(guò)多血細(xì)胞的干擾，一般采用剪斷動(dòng)物頸動(dòng)脈放血的方法處死動(dòng)物，然后用水浸濕體表的被毛（或用新潔爾滅溶液）。將動(dòng)物固定在解剖板上，使其背部向上，先用碘酒棉球消毒背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦過(guò)的部位。
4.取腎
在腰部的后緣，用解剖剪提起皮膚，剪開(kāi)皮膚，將剪開(kāi)的皮膚分別拉向兩邊。此時(shí)，再換一把解剖剪及解剖鑷，剪開(kāi)背部的肌肉，暴露出腹腔，即可見(jiàn)到腎臟（一般右腎略低于左腎），用彎頭*取出腎臟，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。
5.剪腎
用眼科剪及鑷，將腎膜剪破，并將其剝向腎門，去腎膜及脂肪。再用Hank液洗滌一次，再將洗過(guò)的腎臟轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中。另?yè)Q一把眼科剪及鑷，沿腎臟的縱軸剪開(kāi)，去掉腎盂部分，將腎剪成數(shù)塊，然后用Hank液洗滌一次。將洗過(guò)的腎塊轉(zhuǎn)移入無(wú)菌的*瓶（或小燒杯）中。用彎頭眼科剪，將腎剪成1立方毫米大小的塊，組織塊的大小應(yīng)盡量均勻一致，再用Hank液洗滌2～3次，直到液體澄清為止。
6.消化及分散組織塊
將上步清洗過(guò)的Hank液吸掉，按組織塊體積的5～6倍量加入0.25%*液（pH為7.6~7.8）。置于37℃水浴中進(jìn)行消化。消化時(shí)間在20～40分鐘左右（消化時(shí)間的長(zhǎng)短與多種因素有關(guān)，如蛋白酶的活性及濃度，不同動(dòng)物及年齡，組織塊的大小等等）。每隔10分鐘搖動(dòng)一次*瓶，以便組織塊散開(kāi)，以利于繼續(xù)消化，直到組織變成松散、粘稠狀，并且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。這時(shí)可從水浴中取出*瓶，吸去*液，再用 Hank洗滌2～3次。然后，加入少量乳漢液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，直到大部組織塊均勻分散成混淆的細(xì)胞懸液為止。此時(shí)，可將分散的細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)滅菌的紗布（或不銹鋼網(wǎng)）進(jìn)行過(guò)濾，以除去部分較大的組織碎片。
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