在RIA中，標(biāo)記抗原質(zhì)量的優(yōu)劣，直接影響測(cè)定結(jié)果，必須制備比放射性強(qiáng)、純度高的標(biāo)記抗原，并保持免疫活性不受喪失。
一、同位素的選擇
同位素有穩(wěn)定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時(shí)放出的放射線進(jìn)行測(cè)量，這種測(cè)量較靈敏而方便，故多用放射性同位素。標(biāo)記抗原，常用的放射性同位素有3H、14C、131I和125I等。在使用上各有其優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)所進(jìn)行的放射免疫分析的類型特點(diǎn)，標(biāo)記物制備和供應(yīng)情況以及實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件等作適當(dāng)?shù)倪x擇（表8-1）。大多數(shù)抗原分子中都含有C、H等原子，所以用14C或3H標(biāo)記不改變抗原的結(jié)構(gòu)及其免疫學(xué)活性，且14C、3H半衰期長(zhǎng)，所標(biāo)記的抗原長(zhǎng)時(shí)間放置后仍可使用，這都是其優(yōu)點(diǎn)。14C或3H標(biāo)記的不足之處是操作較繁瑣，并難以獲得高比放射性的標(biāo)記物；3H及14C放出的都是弱β射線，需用較昂貴的液體閃爍計(jì)數(shù)器方能獲得較率的測(cè)量，且測(cè)定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標(biāo)記容易喪失免疫化學(xué)或生物學(xué)活性者，則仍以采用3H或14C標(biāo)記物為佳。
表8-1 標(biāo)記抗原常用的放射性同位素及其性質(zhì)
| 放射性元素 | 半衰期 | 射線種類及能量（百萬(wàn)電子伏特） |
| | | β | γ |
| 14C | 5720年 | 0.155 | － |
| 3H | 12.5年 | 0.0189 | － |
| 125I | 60天 | － | 0.035 |
| 131I | 8.05天 | 0.608，0.335，0.250 | 0.364，0.637，0.722 |
大多數(shù)抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結(jié)構(gòu)，往往容易損傷抗原的免疫化學(xué)活性；且放射性碘的半衰期較短，標(biāo)記物放置后因衰變使放射性降低，因而需要經(jīng)常制備標(biāo)記物或要求能定期提供放射性碘標(biāo)記都能適用，放射性碘放出γ—射線，用一般晶體閃爍計(jì)數(shù)器就能獲得較率而的測(cè)量，測(cè)量操作也很簡(jiǎn)單。由于這些突出的優(yōu)點(diǎn)，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘標(biāo)記物zui多。
從應(yīng)用角度來(lái)看，131I和125I又各有其優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規(guī)格等條件合理選用。但相對(duì)而言，125I有較多的優(yōu)點(diǎn)，一是半衰期適中，允許標(biāo)記化合物的商品化及貯存應(yīng)用一段時(shí)間；二是它只發(fā)射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線，而無(wú)β粒子，因而輻射自分解少，標(biāo)記化合物有足夠的穩(wěn)定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對(duì)象（包括蛋白質(zhì)、肽類、固醇類、核酸類以及環(huán)型核苷酸衍生物等）的標(biāo)記，且操作簡(jiǎn)單，一般實(shí)驗(yàn)室都不難做到。
二、蛋白質(zhì)與多肽激素的
要制備高比度、高純度與免疫化學(xué)活性好的標(biāo)記物，首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標(biāo)記加網(wǎng)免疫分析的特異性，所以若用純度不高的抗原作標(biāo)記，則標(biāo)記后必須采取適當(dāng)?shù)牟襟E除去雜質(zhì)，以獲得高純度的標(biāo)記物。標(biāo)記對(duì)象的純化應(yīng)盡量采用溫和的方法，否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質(zhì)（這時(shí)表面上活性可能還是良好的），再經(jīng)標(biāo)記反應(yīng)時(shí)所受的損傷，活性就會(huì)顯著降低，影響以后的放射分析結(jié)果。有了好的純抗原，還要采用適當(dāng)方法加以標(biāo)記，盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學(xué)活性的標(biāo)記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關(guān)鍵問(wèn)題。
多肽激素與蛋白質(zhì)多用碘標(biāo)記，zui常用的是125I。碘化反應(yīng)的基本過(guò)程如下：通過(guò)氧化劑的作用，使碘化物（125I-）氧化成的碘分子（125I2），再與多肽激素、蛋白質(zhì)分子中的*殘基發(fā)生碘化作用。所以不管采用哪一種法，標(biāo)記的化合物內(nèi)部必須有碘原子可結(jié)合的基團(tuán)，即結(jié)構(gòu)上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質(zhì)、肽類等抗原，在結(jié)構(gòu)上含有上述基團(tuán)的可直接用放射性碘進(jìn)行標(biāo)記。如不含上述基團(tuán)的，放射性碘無(wú)法標(biāo)記，必須在這些化合物的結(jié)構(gòu)上連接上述基團(tuán)后才能進(jìn)行碘標(biāo)記。
因此影響蛋白質(zhì)、多肽碘化效率的因素，主要決定于蛋白質(zhì)、多肽分子中*殘基的數(shù)量及它們?cè)诜肿咏Y(jié)構(gòu)中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反應(yīng)條件（pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間等）及所用氧化劑的性質(zhì)等也有影響。
（2）生物活性和免疫活性測(cè)定的要求：需根據(jù)使用要求而定，因?yàn)橥粯?biāo)記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關(guān)；同一標(biāo)記激素，其與受體結(jié)合能力的改變與抗體結(jié)合能力的改變也不一定平行。 ?。?）測(cè)定方法：測(cè)定標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種：
?、傥锢砘瘜W(xué)方法：可用電泳法、吸附法及凝膠過(guò)濾法等物理化學(xué)方法來(lái)測(cè)定標(biāo)記蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變情況，如標(biāo)記后受損全傷的蛋白質(zhì)在電泳時(shí)泳動(dòng)性減少，碘化受損的多肽激素在血紅蛋白涂碳上的吸附性質(zhì)也有改變，而蛋白質(zhì)變性聚合時(shí)大分子聚合體將在凝膠過(guò)濾時(shí)不停留在凝膠柱上。這些測(cè)定雖較快速方便，但對(duì)標(biāo)記物的生物活性和免疫活性的嚴(yán)格判定來(lái)說(shuō)，還是很不夠的。
?、谔禺惤Y(jié)合試驗(yàn)：根據(jù)放射性標(biāo)記化合物用于放射免疫分析等不同要求，分別與其相應(yīng)抗體或受體進(jìn)行特異性結(jié)合試驗(yàn)。以放射免疫分析試劑為例，測(cè)定其免疫活性的方法是：先觀察標(biāo)記物與抗體的結(jié)合率，如果結(jié)合率高，說(shuō)明抗原的免疫活性較好。進(jìn)一步觀察標(biāo)記抗原與非標(biāo)記對(duì)抗體親合力是否一致，做法之一是用不同稀釋度的抗體，分別與標(biāo)記抗原及與標(biāo)記抗原加非標(biāo)記抗原的混合物進(jìn)行特異結(jié)合，其中混合物抗原總濃度要和單獨(dú)使用放射性抗原的濃度相同。如單獨(dú)使用標(biāo)記抗原1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標(biāo)記抗原為0.1ng，非標(biāo)記抗原為0.9ng，比較兩者的結(jié)合率，如果基本相同，說(shuō)明標(biāo)記抗原保持其原來(lái)的親和力，在標(biāo)記等操作過(guò)程中未受到明顯損傷。如圖8-5中，A線與B線基本平行；如果標(biāo)記抗原免疫活性已有降低，則如C線所示。
圖8-5 標(biāo)記蛋白的免疫活性測(cè)定
A；為標(biāo)記抗原與血清的滴度曲線B：為非標(biāo)記抗原（加入少量標(biāo)記抗原）的滴度曲線；C：與A相同，但標(biāo)記抗原免疫活性已有降低
?、凵锾匦詼y(cè)定：如125I—纖維蛋白原，可用*測(cè)定其可凝能力，與非標(biāo)記物相比，視是否有改變。使用何種生物特性測(cè)定，根據(jù)標(biāo)記物的生物性質(zhì)而定。另外，上述特異性結(jié)合試驗(yàn)，如果受體作異結(jié)合劑，也是檢驗(yàn)用作RRA或RBA分析試劑的標(biāo)記物生物活性情況的有效方法。
會(huì)員1.png)