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行業(yè)產(chǎn)品

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上海酶聯(lián)生物研究所


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技術(shù)文章

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理、特點(diǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域介紹

閱讀:425發(fā)布時(shí)間:2011-11-23

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)可對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后,我們可以通過(guò)凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析,也可以通過(guò)放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來(lái)進(jìn)行定量的分析。無(wú)論定性還是定量分析,分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下,我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號(hào)放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡(jiǎn)稱(chēng)Real Time PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied biosystems公司推出,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,使每一個(gè)循環(huán)變得“可見(jiàn)”,zui后通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)zui敏感、zui準(zhǔn)確的方法。如果用于RNA檢測(cè),這被稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR即(Real-time RT-PCR)是實(shí)時(shí)PCR法,它是指對(duì)DNA或經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)入(RT-PCR)的RNA通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的放大過(guò)程,在擴(kuò)增的指數(shù)增長(zhǎng)期就測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物,因?yàn)閿U(kuò)增指數(shù)增長(zhǎng)期測(cè)量值與特異DNA(RNA)起始量存在相關(guān)性,從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。RealTime PCR的基本目標(biāo)是測(cè)量和鑒別非常微量的特異性核酸,從而可通過(guò)監(jiān)測(cè)CT值而實(shí)現(xiàn)對(duì)原始目標(biāo)基因的含量定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法zui大的優(yōu)點(diǎn)是克服了終點(diǎn)PCR法進(jìn)入平臺(tái)期或叫飽和期后定量的較大誤差,實(shí)現(xiàn)DNA/RNA的定量。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量,而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn),該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)及臨床醫(yī)學(xué)研究方面有著重要的意義。


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