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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：276發(fā)布時(shí)間：2011-11-1
隨著分子生物學(xué)研究發(fā)展的不斷廣泛和深入，PCR已成為一門相當(dāng)成熟的常規(guī)技術(shù)，而熱聚合酶（即Taq酶）的合理選擇是PCR成敗與否的一個(gè)關(guān)鍵因素。目前市面上有多種Taq酶，能夠滿足多方面的實(shí)驗(yàn)需要。那么，如何選擇zui合適的Taq酶？根據(jù)用戶經(jīng)?？紤]的指標(biāo)，如特異性、保真性、耐熱性、擴(kuò)增速率、擴(kuò)增片段長度、能否進(jìn)行復(fù)雜模板擴(kuò)增以及優(yōu)化條件難易等等，我們在這兒將主要的Taq酶歸歸類，其性質(zhì)、用途也就一目了然了。
高特異性Taq酶
高度特異性地?cái)U(kuò)增所需的片段是PCRzui基本的要求，影響PCR特異性的因素很多，包括模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應(yīng)條件的控制等等，而高特異性Taq 酶的出現(xiàn)大大減少了摸條件這一繁瑣的實(shí)驗(yàn)過程，也為PCR產(chǎn)物快速有效的純化（PCR產(chǎn)物直接純化）打下了基礎(chǔ)。這類酶zui典型的代表是熱啟動(dòng)Taq酶。大家都知道，在PCR*個(gè)循環(huán)變性之前，有一個(gè)升溫的過程，引物和模板會有一些非特異性配對，如果這時(shí)Taq酶發(fā)揮活性，就很容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，由于循環(huán)初期模板量非常少，產(chǎn)生的非特異性條帶經(jīng)過后面的指數(shù)擴(kuò)增，就會嚴(yán)重干擾目的片段的擴(kuò)增，甚至導(dǎo)致特異性條帶不能擴(kuò)出。而熱啟動(dòng)Taq酶是必需經(jīng)過高溫才能激活的酶，因此在初始循環(huán)的變性之前它沒有活性，不會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，這就大大提高了PCR擴(kuò)增的特異性。*代熱啟動(dòng)Taq酶往往直接在Taq 酶上做一些修飾，比如用抗體抑制，蠟封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些產(chǎn)品，由于抗體、蠟等異物的摻入，對實(shí)驗(yàn)造成一定的影響，也給試驗(yàn)者帶來一些不便。新一代的熱啟動(dòng)Taq酶是通過內(nèi)部改造的重組酶，真正實(shí)現(xiàn)便利的熱啟動(dòng)，代表產(chǎn)品如QIAGEN公司的 HotStar系列，無需別的輔助抑制物，也不用擔(dān)心抑制不穩(wěn)定，使用起來方便、。此外，由于幾乎所有的Taq酶產(chǎn)品都帶有相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液，緩沖液的品質(zhì)也對保證Taq酶特異性擴(kuò)增起著不可忽視的作用，一般的緩沖液中調(diào)節(jié)H鍵作用的鹽只有KCl，QIAGEN公司的緩沖體系通過 KCl、（NH4）SO4鹽離子體系的平衡調(diào)節(jié)也提高了酶作用的特異性。
此外，熱啟動(dòng)的Taq酶也是實(shí)現(xiàn)一步法RT-PCR的基礎(chǔ)。如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR試劑盒，在RT反應(yīng)較低溫度下，Taq酶沒有活性，逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)揮活性；RT反應(yīng)結(jié)束，高溫滅活逆轉(zhuǎn)錄酶的同時(shí)，激活Taq酶，進(jìn)行PCR反應(yīng)。另一家公司Epicentre有一種MasterAmpTM Tth DNA聚合酶，本身就具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，也可用作RT-PCR。
高保真Taq酶
下游應(yīng)用為基因篩選、測序、突變檢測，分子診斷等等的用戶，往往對PCR保真性要求很高，保真性的一個(gè)通用標(biāo)準(zhǔn)是錯(cuò)配率，錯(cuò)配率越低保真性越好。普通Taq酶的錯(cuò)配率在2-5X10-5堿基/循環(huán)數(shù)，而高保真Taq酶錯(cuò)配率可達(dá)10-6數(shù)量級，大大降低了出錯(cuò)的可能。其原理主要是因?yàn)楦弑Ｕ鎀aq酶具有3‘到5’核酸外切酶（Proofreading）的活性，擴(kuò)增途中如果產(chǎn)生了錯(cuò)配的堿基，它可以將其切掉，從而保證了擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。需要提醒用戶的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往擴(kuò)增效率低一些，有的還容易降解引物，且產(chǎn)物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。目前市面上主要有兩類產(chǎn)品，一類是混合型的高保真酶，將帶有Proofreading活性的酶與普通Taq酶（用于提高擴(kuò)增效率）混合起來，錯(cuò)配率在8-9 X10-6堿基/循環(huán)數(shù)。Clontech、LTI等公司都有此類產(chǎn)品。如果要求更高的保真度，就要選擇單一型的高保真酶，如Stratagene的 Pfu，NEB公司的Vent DNA 聚合酶，錯(cuò)配率5.7 X10-5堿基/循環(huán)數(shù)；QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，兼特異性與保真性于一體，其聚合酶及Proofreading活性都為熱啟動(dòng)，可避免引物降解，錯(cuò)配率達(dá)2-4×10-6堿基/循環(huán)數(shù)，加上優(yōu)化的反應(yīng)體系，可在室溫下配置反應(yīng)液，可進(jìn)行復(fù)雜模板（高GC含量、二級結(jié)構(gòu)）及長片段的擴(kuò)增，的確是這類酶中的*。 高耐熱性Taq酶 對于有些模板變性溫度較高，需要時(shí)間較長的用戶，可能要求高耐熱性Taq酶，這里介紹NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，兩者都是從海底火山口分離出來后克隆的，是普通Taq酶耐熱性的三倍以上，前者在95℃半衰期近7小時(shí)，100℃近2小時(shí)；后者更甚，分別為23小時(shí)和8小時(shí)。
超長片段擴(kuò)增Taq酶
對于作基因組圖譜、測序及分子遺傳學(xué)研究的用戶，可能會用到超長片段的擴(kuò)增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和熱啟動(dòng)抗體，對復(fù)雜模板可擴(kuò)增10kb片段，簡單模板可達(dá)40kb。
關(guān)于復(fù)雜模板的擴(kuò)增
對于模板結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如GC含量高（>60%），有二級結(jié)構(gòu)等，普通的Taq酶可能難以延伸下去，加入DMSO等助熔劑可幫助擴(kuò)增順利進(jìn)行，但 DMSO有毒，而且用量需要優(yōu)化。QIAGEN公司的任何一種Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，對復(fù)雜模板的擴(kuò)增特別有效。
關(guān)于條件的優(yōu)化
現(xiàn)下很多的生物試劑公司都提供優(yōu)化的緩沖液，如QIAGEN公司的緩沖體系，對溫度和Mg2+的耐受性很強(qiáng)，隨試劑盒有推薦的操作手冊，大大減少了反應(yīng)條件的優(yōu)化，如果結(jié)合好的引物設(shè)計(jì)軟件和高質(zhì)量的模板引物，一次成功率*。但任何東西都不是的，如果碰到比較特殊的情況，還需要仔細(xì)分析，優(yōu)化調(diào)整。
以上就Taq酶的一些基本分類分別進(jìn)行了介紹，具體選購時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要擇其重點(diǎn)，再參照其他參數(shù)，才能選到zui合適的Taq酶。我們會及時(shí)將的技術(shù)和產(chǎn)品推薦給大家，希望能幫助大家更快更好的達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/a>
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