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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：3017發(fā)布時間：2010-9-29
一、目的
學習纖維素薄層層析的操作方法，掌握分配層析的原理。
二、原理
以纖維素作為支持物，把它均勻地涂布在玻璃板上成一薄層，然后在此薄層上進行層析即為纖維素薄層層析。纖維素是一種惰性支持物，它與水有較強的親和力而與有機溶劑親和力較弱。層析時吸著在纖維素上的水是固定相，而展層溶劑是流動相。當欲被分離的各種物質在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同時，它們就能被分離開。
三、實驗材料、儀器和試劑
1．實驗材料
綠豆芽或萌發(fā)小麥種子
2．儀器
燒杯50mL×1；玻璃板5 cm×20cm×1；層析缸；毛細管；噴霧器；研缽。
3．試劑
標準氨基酸溶液：*、*、*，分別以0.01mol/L 鹽酸配成4mg/mL 的溶液。
纖維素粉（層析用）或微晶型纖維素（層析用）；羧甲基纖維素鈉（CMC）。層析溶劑系統(tǒng)：正丁醇（分析純）﹕冰醋酸（分析純）﹕水＝4﹕1﹕1（V/V）。顯色劑：0.1％茚三酮-丙酮溶液。
四、操作步驟
1．氨基酸的提取
取已萌發(fā)好的小麥種子2g（或綠豆芽下胚軸2g），放入研缽中，加95％乙醇4mL 及少量的石英砂，研成勻漿后，倒入離心管中離心3 000r/min、15min，上清液即為氨基酸提取液，用滴管小心吸入點樣瓶中備用。
2．制板
取少量羧甲基纖維素鈉（約12mg），置研缽中充分研磨，再稱取纖維素粉3g 于研缽中研磨，再加入14mL 水研磨勻漿，把纖維素勻漿倒在洗凈烘干的玻璃板上，輕輕震動，使纖維素均勻分布在玻璃板上，水平放置風干，用前放入100～110℃烘箱中活化30min。此處羧甲基纖維素鈉是起粘合劑作用，它使纖維素粉能較牢固地粘附于玻璃板上，加入量過多會破壞纖維素薄層的毛細作用而使層析速度延緩，加的量過少則粘合不牢固，因此需要注意加量控制。
3．點樣
用刀片將薄層板上薄層的左右各邊刮削掉0.5cm，以防止“邊緣效應”。在纖維素薄板上距一端15mm 處，用鉛筆輕輕劃出點樣記號。樣點之間距離1.3cm。用毛細管吸取樣品，在記號處點樣，樣品斑點直徑控制在2mm 左右。
4．展層
將薄板有樣品的一端浸入已存放展層溶劑的層析缸中，層析溶劑液面不能高于樣品線。待展層溶劑走到距薄板頂端0.5～1cm 時取出此薄板（約1～2h），用鉛筆在前沿處作一記號后用電吹風吹干。
5．顯色
將茚三酮顯色劑噴霧在板上，用熱吹風吹數(shù)分鐘，（或置于70～80℃烘箱中烘干）即可觀察到紫紅色的氨基酸斑點，*例外，為黃色斑點。用鉛筆圈出氨基酸斑點，量出溶劑前沿的距離及各斑點中心與起點之間的距離，并計算各氨基酸的Rf 值。Rf 值為遷移率（rate of flow, Rf），在恒定條件下，每種氨基酸有其一定的Rf 值。Rf 值表示為：
根據(jù)已知標準氨基酸和Rf 值，與小麥（或綠豆芽）提取液中氨基酸的Rf 值比較，確定提取液中含有哪些種氨基酸。
五、附 注
1．在操作過程中，手必須洗凈，只能接觸薄板上層邊角；不能對著薄板說話，以防唾液掉在板上。
2．配制展層劑時，要用純溶劑，應現(xiàn)用現(xiàn)配，以免放置過久其成分發(fā)生變化（酯化）。
六、思考題
1．什么是分配系數(shù)？
2．薄層層析中極性氨基酸與非極性氨基酸展層的速度哪個快一些？
3．何為“邊緣效應”？如何減輕或消除？
叁考答案
1．分配系數(shù)是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質在兩相溶劑中的濃度比值。在層析條件確定后分配系數(shù)是一常數(shù)，以K 表示。
分配系數(shù)與溶劑和溶質的性質有關，同時受溫度、壓力的影響。所以不同物質的分配系數(shù)不同。而在恒溫恒壓條件下，某物質在確定的層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)為一常數(shù)。
2．層析的分離是基于氨基酸的非極性性質。物質的極性越?。捶菢O性越大），在有機溶劑中分配就越多，遷移率就越大；反之物質的極性越大，遷移率越小。所以非極性氨基酸在有機溶劑中展層的速度快于極性氨基酸。
3．在用多元系統(tǒng)進行展層時，其中極性較弱的和沸點較低的溶劑（例如氯仿-甲醇系統(tǒng)中的氯仿）在薄層板的兩邊易揮發(fā)，因此，它們在薄層兩邊的濃度比在中部的濃度小，也就是說在薄層的兩邊比中部含有更多的極性較大或沸點較高的溶劑，于是位于薄層兩邊的Rf 值要比中間的高，即所謂“邊緣效應”。為減輕或消除邊緣效應，可在層析缸的內壁貼上浸濕了展開劑的濾紙，使層析缸內溶劑蒸汽的飽和程度增加。
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