通過CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)的組成型過量表達(dá)而產(chǎn)生的擬南芥突變體，通常在T1代是嵌合體。七月二十一日，來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員在生物學(xué)期刊《Genome Biology》發(fā)表的一項(xiàng)研究中，利用卵細(xì)胞特異性的啟動子，來驅(qū)動Cas9的表達(dá)，并以很高的效率獲得了多個靶基因的非嵌合性T1突變體。延伸閱讀：用CRISPR編輯樹木基因組。
本文通訊作者是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的陳其軍博士，其2002年在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲博士學(xué)位，2004年9月起在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院從事教學(xué)及科研工作，主要研究方向?yàn)椋褐参锓巧锬婢趁{迫反應(yīng)重要基因挖掘及功能鑒定；多基因轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺的建立及其在抗逆基因工程中的應(yīng)用研究；Ta-siRNAs的生物合成調(diào)控及在抗逆基因挖掘中的應(yīng)用研究。
大量擬南芥序列索引的T-DNA插入突變體，對于直接研究基因功能，發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。然而，有兩大障礙限制了這些全基因組表型篩選的應(yīng)用。首先，大部分株系是半合子的，因此需要一個額外的步驟來確定純合植株，用于表型分析。第二，12%的基因沒有T-DNA插入突變體可用，8%的基因只由一個單一的等位基因代表。此外，剖析具有冗余功能的基因家族成員所扮演的角色，以及分析遺傳途徑中的上位性，經(jīng)常需要攜帶多個基因突變的植物。
利用T-DNA插入誘變產(chǎn)生多基因突變的一個障礙是，這種方法需要費(fèi)時(shí)費(fèi)力的單突變體植株遺傳雜交。序列特異性核酸酶的進(jìn)展，包括大范圍核酸酶、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs），和zui近的CRISPR/cas9系統(tǒng)，為開發(fā)快速、劃算的方法來產(chǎn)生新的突變植物群體和多基因突變植株，鋪平了道路。
CRISPR/cas9系統(tǒng)使用一種單向?qū)NA（sgRNA）提供序列特異性，并依賴sgRNA/Cas9復(fù)合物的核酸內(nèi)切酶活性，在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂；這些雙鏈斷裂可導(dǎo)致宿主細(xì)胞中DNA修復(fù)系統(tǒng)的激活，通常是通過非同源末端連接途徑。由于修復(fù)途徑是容易出錯的，因此在修復(fù)過程中將會引入小的缺失或插入，從而產(chǎn)生突變。這種、易于使用的系統(tǒng)，可以用來產(chǎn)生多路復(fù)用的基因組修飾，并取代ZFNs和TALENs，成為標(biāo)準(zhǔn)的基因組編輯技術(shù)。
在脊椎動物中，將體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到單細(xì)胞胚胎中，可地產(chǎn)生多基因的雙等位基因突變動物；多基因突變也可以有效地傳遞給下一代。然而，在植物中，細(xì)胞壁的存在使得RNA注射方法不切實(shí)際。制備可表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因株系，提供了一種替代方法。
用來制備轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的技術(shù)包括：植物原位轉(zhuǎn)化和胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化。植物原位轉(zhuǎn)化zui典型的例子是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化，其卵細(xì)胞是T-DNA的靶標(biāo)。胚性細(xì)胞來源的轉(zhuǎn)基因株系（表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)），編輯的靶基因在*代植株中是純合的，說明在*次細(xì)胞分裂之前，靶基因就在轉(zhuǎn)化的胚性細(xì)胞中被編輯。番茄和玉米中也報(bào)道過類似的結(jié)果。這些結(jié)果對于作物基因組編輯的發(fā)展來說，是令人鼓舞的，因?yàn)樽魑镛D(zhuǎn)化通常采用胚性愈傷組織細(xì)胞，它們可以被認(rèn)為類似于單細(xì)胞階段的動物胚胎。
擬南芥非常適合于原位轉(zhuǎn)化，CRISPR/Cas9系統(tǒng)理論上應(yīng)該在單細(xì)胞階段的胚胎中發(fā)揮作用。然而，表達(dá)CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)基因株系，在*代（T1）主要是嵌合體，從而表明擬南芥中CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的突變發(fā)生在*個胚胎細(xì)胞分裂之后。也許CRISPR/Cas9不能在單細(xì)胞階段的胚胎中發(fā)揮功能，是由于組成型花椰菜花葉病毒35S啟動子（CaMV 35S）在卵細(xì)胞和單細(xì)胞階段胚胎中的活性較弱。
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用卵細(xì)胞特異性EC1.2基因的啟動子，來驅(qū)動Cas9在擬南芥中的表達(dá)，表明CRISPR/Cas9在卵細(xì)胞和單細(xì)胞階段胚胎中的特異性表達(dá)，可有效地使T1代擬南芥產(chǎn)生多個靶基因的純合子或雙等位基因突變體。要識別*突變的、非嵌合性的株系，通常需要對從25-50個T1轉(zhuǎn)基因植株中篩選的一些候選株系，進(jìn)行靶位點(diǎn)的中度測序（通過限制性內(nèi)切酶分析、T7E1試驗(yàn)或Surveyor檢測）。
然而，目前這種策略可以縮短所需的時(shí)間，在一個世代中產(chǎn)生這樣的突變體，從而提供一種更快、更具成本效益的方法，來制備新的擬南芥突變?nèi)后w和多基因突變體。根據(jù)對啟動子和終止子的不同組合進(jìn)行比較，研究人員還提出了一種方法，來優(yōu)化卵細(xì)胞特異性啟動子控制的（EPC）CRISPR/Cas9系統(tǒng)。
會員1.png)