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ELISA方法檢測(cè)牛分枝桿菌抗體研究及應(yīng)用
E LI sA 診斷抗原選擇結(jié)核分枝桿菌特異性抗原M p B s 3、M p B 7 o、e F P l o 和E s A T 一6 是近幾年討論和研究的熱點(diǎn), 被認(rèn)為是比較有希望的牛結(jié)核病特異性診斷候選抗原。
這些抗原用于E U S A 檢測(cè)結(jié)核病的研究還不多。M P B 70 是牛分枝桿菌感染過(guò)程中重要的體液和
細(xì)胞免疫目標(biāo)抗原, 可作為牛分枝桿菌感染的診斷試劑1201。但由于M P B 70 是B c G 中的一種重要成分,因此不能區(qū)分自然感染和B C G 免疫。已有的報(bào)道顯示,M P B 70 用于E LI s A 檢測(cè)牛結(jié)核病的特異性可達(dá)90 % 以上, 而敏感性卻很不穩(wěn)定7[, “ ,。M P B 83 是牛分枝桿菌表面相關(guān)的分泌型脂蛋白, 在牛分枝桿菌中高水平表達(dá), 但在結(jié)核分枝桿菌中很少表達(dá)l2l]。據(jù)報(bào)道, M p B 83 能夠檢測(cè)出結(jié)核病牛, 并能區(qū)分出B c G 免疫牛l2]。M P B 83 檢測(cè)結(jié)核牛血清抗體有較高的特異性, 但敏感性卻有爭(zhēng)議9l[。sE A 6T 和c F 1P 0 是結(jié)核分枝桿菌早期分泌蛋白〔23] ,由于他們只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其它幾種致病性分枝桿菌中, 且都在卡介苗中缺失, 因此有望成為鑒別診斷候選抗原。用E S A T一6 檢測(cè)結(jié)核病牛血清抗體敏感性和特異性分別達(dá)到了98.6 % 和98.5 % 81[。c FlP o 檢測(cè)抗體的特異性也很高, 但單獨(dú)用c F P 10 作為抗原檢測(cè)結(jié)核抗體敏感性很低【’ 01。E s A T 一6 和c F P 10 重組抗原的運(yùn)用不僅可以提高結(jié)核檢測(cè)的敏感性「川, 而且能用于鑒別卡介苗免疫與臨床自然感染工25]。
E LI s A 方法二十多年前就已經(jīng)被用于結(jié)核病的診斷, 然而多年來(lái)一直沒(méi)有得到推廣應(yīng)用, 主要原因是其特異性、敏感性和穩(wěn)定性都不十分令人滿意。我們選用上述3 種結(jié)核菌特異性抗原, 有望提高E lL s A 診斷方法的特異性和敏感性, 為我國(guó)牛結(jié)核病的臨床診斷提供。3.2 E U S A 條件的改進(jìn)比較已報(bào)道的E l S A 檢測(cè)方法, 本研究擯棄了二抗稀釋液中牛血清白蛋白(B S A ) 的使用, 排除了B S A 對(duì)E U S A 檢測(cè)的可能干擾[ ’ 9] , 同時(shí)提高了酶標(biāo)二抗的使用效率, 在不影響檢測(cè)結(jié)果的條件下, 將酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)從l : 2 0 0 0 0 提高到l : 10 0 0 0 0。3.3 E LI S A 的敏感性和特異性由于結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)( T s )T 是oI E 及我國(guó)的牛結(jié)核病檢疫的推薦方法, 因此, 本研究用T S T 作為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)E LI S A 的敏感性。細(xì)菌學(xué)檢查雖是結(jié)核病診斷的標(biāo)準(zhǔn), 但檢出率低, 檢測(cè)條件要求高, 因此, 我們?cè)诒驹囼?yàn)室開(kāi)展細(xì)菌分離試驗(yàn), 只是借助武漢市結(jié)核病防治院(所) 的條件, 做了小范圍的細(xì)菌分離鑒定, 以證實(shí)E IL s A 檢測(cè)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明, 用E LI S A 方法同時(shí)檢測(cè)3 種蛋白的血清抗體, 其與T S T 的陽(yáng)性符合率或敏感性可達(dá)70.4 %。由于抗體陽(yáng)性與病程成正比, 推測(cè)E LI S A 檢測(cè)強(qiáng)陽(yáng)性?？赡艹霈F(xiàn)臨床或病理癥狀, 因此, 進(jìn)一步分菌鑒定, 結(jié)果證實(shí)了5 頭牛為細(xì)菌分離陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)室買下了其中一頭, 解剖發(fā)現(xiàn)了典型的結(jié)核病病理變化(資料未顯示)。對(duì)5 頭細(xì)菌分離陽(yáng)性牛進(jìn)行T S T 檢測(cè), 結(jié)果3 頭陽(yáng)性, 2 頭可疑, 進(jìn)一步證實(shí), E LI S A 方法的可靠性較高, 檢測(cè)重度感染牛具有更高的敏感性。同時(shí), 檢測(cè)結(jié)果表明, E LI S A 并不能包含全部的T S T 陽(yáng)性牛, 而T S T 也不能包含全部的E IL S A陽(yáng)性牛, 這一點(diǎn)與機(jī)體抗結(jié)核菌的免疫規(guī)律是一致的。早在19 7 7 年,eL nz in 26[] 等就發(fā)現(xiàn)了結(jié)核病的細(xì)胞免疫與體液免疫分離的現(xiàn)象, 并指出細(xì)胞免疫在感染早期出現(xiàn), 隨病情加重而減弱, 體液免疫隨病情加重而增強(qiáng)。因此, E IL S A 抗體檢測(cè)有利于檢出與淘汰危險(xiǎn)性大的嚴(yán)重感染牛。此外, T s T 與E IL s A 結(jié)果的差異還可能與T S T 存在嚴(yán)重的非特異性反應(yīng)[ ’ 〕及因機(jī)體免疫力底下而引起的假陽(yáng)性反應(yīng)’ 2 , ’ 有關(guān)。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明, 本研究建立的ElL s A 方法與牛的5 種主要病原無(wú)血清學(xué)交叉反應(yīng), 顯示出良好的特異性。至于該E LI S A 方法能否鑒別診斷其他分枝桿菌感染及B C G 免疫還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述, 本研究所建立的間接E LI S A 方法可有效檢測(cè)幾種牛結(jié)核病特異蛋白的抗體, 在初步應(yīng)用中表現(xiàn)了良好的敏感性和特異性。由于抗體陽(yáng)性與牛結(jié)核病的病程呈正相關(guān), 而皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)與病程呈負(fù)相關(guān), 因此檢測(cè)抗體的間接E u s A 方法與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)具有較強(qiáng)的互補(bǔ)性。由于抗體檢測(cè)省時(shí)省力, 易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化與程序化, 在我國(guó)及世界上部分發(fā)展中國(guó)家的牛結(jié)核病嚴(yán)重流行地區(qū), 檢測(cè)抗體的間接E U S A 方法應(yīng)當(dāng)具有重要的應(yīng)用價(jià)值
