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一、ELISA基本原理
ELISA通過抗原-抗體的特異性結(jié)合，利用酶催化底物顯色反應(yīng)進(jìn)行定量或定性分析。常見的類型包括直接法、夾心法和競爭法，但其核心步驟均依賴于以下三類關(guān)鍵試劑：
二、核心試劑一：包被抗體/抗原——實驗的“基石"?
作用?：作為固相載體（微孔板）的固定化分子，捕獲目標(biāo)物。
選擇要點?：
純度與活性?：高純度避免交叉反應(yīng)，確保結(jié)合效率（建議使用單克隆抗體）。
包被濃度優(yōu)化?：預(yù)實驗確定最佳濃度（通常1-10 μg/mL），濃度過高易導(dǎo)致空間位阻。
緩沖液選擇?：碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）常用，避免含BSA或Tween的溶液。
常見問題?：
非特異性結(jié)合?：增加封閉步驟（如5%脫脂牛奶或BSA封閉1小時）。
包被不均?：4℃過夜包被優(yōu)于室溫2小時，提高結(jié)合穩(wěn)定性。
三、核心試劑二：酶標(biāo)抗體——信號的“放大器"?
作用?：與目標(biāo)物結(jié)合后催化底物顯色，將生物學(xué)信號轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號。
酶的種類?：
HRP（辣根過氧化物酶）?：常用，底物為TMB（顯藍(lán)色）或OPD（顯黃色），靈敏度高。
AP（堿性磷酸酶）?：底物為pNPP（顯黃色），適用于磷酸鹽緩沖體系。
標(biāo)記效價?：高效價減少用量，降低成本（建議效價≥1:5000）。
保存條件?：HRP需避光保存，避免反復(fù)凍融（分裝后-20℃儲存）。
注意事項?：避免與疊氮鈉（HRP抑制劑）共用，可選擇ProClin 300作為防腐劑。
四、核心試劑三：底物顯色系統(tǒng)——結(jié)果的“可視化"?
作用?：酶催化底物生成有色產(chǎn)物，通過吸光度值定量目標(biāo)物濃度。
常用底物對比?：
優(yōu)化技巧?：
顯色時間控制：室溫避光反應(yīng)10-30分鐘，避免過度顯色導(dǎo)致背景升高。
終止時機：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度孔顯色明顯時立即終止。
五、實驗流程關(guān)鍵步驟?
包被?：100 μL/孔，4℃過夜。
封閉?：含1% BSA的PBS，37℃ 1小時。
加樣?：樣本梯度稀釋，37℃孵育1小時。
酶標(biāo)抗體孵育?：37℃ 1小時，洗滌3次（0.05% Tween-20 PBS）。
顯色與終止?：TMB顯色15分鐘，2M H?SO?終止。
讀數(shù)?：雙波長檢測（450 nm/630 nm校正孔間誤差）。
六、常見問題與解決方案?
高背景噪音?：增加洗滌次數(shù)（5次以上），檢查封閉液是否失效。
低信號值?：優(yōu)化包被濃度或延長底物孵育時間。
孔間差異大?：使用多通道移液器，確保加樣一致性。
