人晚期糖基化終末產物受體(RAGE/AGER)ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用
預期應用
ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關液體中晚期糖基化終末產物受體(RAGE/AGER)含量。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中晚期糖基化終末產物受體水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入晚期糖基化終末產物受體抗原、*化的抗人晚期糖基化終末產物受體抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的晚期糖基化終末產物受體呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.313 ng/ml，0.156 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內配制。
如配制5 ng/ml標準品：取0.5ml 10 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
- 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
- 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
- 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
- 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
- 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
- 底物溶液：1×10ml/瓶。
- 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
- 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標本的采集及保存
1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。
2. 血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過一夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?/span>試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
- 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
- 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37℃,60分鐘。
- 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
- 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。
- 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
- 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
- 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
- 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。
3. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
4. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水
紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需
要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人晚期糖基化終末產物受體，且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
- 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
- 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
- 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
- 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。
檢測范圍：
0.156 ng/ml -10 ng/ml
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．有效期：6個月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響。
5．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
