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農(nóng)桿菌介導(dǎo)人胰島素ELISA法檢測(cè)研究

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 農(nóng)桿菌介導(dǎo)人胰島素ELISA法檢測(cè)研究

  農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化其轉(zhuǎn)化效率受到多種因素影響。隨機(jī)挑選5個(gè)抗性菌落進(jìn)行驗(yàn)證，PCR檢測(cè)結(jié)果表明，人胰島素基因已經(jīng)整合到銀耳基因組中；RT-PCR結(jié)果顯示，在銀耳細(xì)胞中可以檢測(cè)到人胰島素基因的mRNA；Southern雜交結(jié)果表明人胰島素基因以單拷貝的形式整合到銀耳基因組DNA中。本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置農(nóng)桿菌與銀耳芽孢不同共培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮的濃度、銀耳芽孢及農(nóng)桿菌濃度等因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響，結(jié)果在乙酰丁香酮濃度為500μmol/mL、銀耳芽孢濃度為108個(gè)/mL、農(nóng)桿菌OD=0.5及共培養(yǎng)時(shí)間為2d時(shí)，轉(zhuǎn)化效率zui高，為310個(gè)轉(zhuǎn)化子/108個(gè)銀耳芽孢。轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接5代后對(duì)潮霉素仍有抗性，說(shuō)明外源基因在銀耳芽孢中能夠不亂遺傳。在實(shí)驗(yàn)室已初步建立的農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)銀耳轉(zhuǎn)基因方法的基礎(chǔ)上，以銀菌株Tr21-01為出發(fā)菌株，通過(guò)凍融法將攜帶有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hph)基由于遺傳標(biāo)記及人胰島素基因(BAC)為目的基因的質(zhì)粒pBHg-BCA導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，LBA4404和AGL-1中，并進(jìn)一步介導(dǎo)轉(zhuǎn)究。實(shí)驗(yàn)結(jié)L-1具有較高的轉(zhuǎn)化率；GV3101轉(zhuǎn)化率較低，且假陽(yáng)性較高；LBA4404無(wú)抗性菌落長(zhǎng)出。此結(jié)果表明不同的農(nóng)桿菌侵染銀耳芽孢能力具有差異性，且對(duì)受體侵染具有一定的特異性。本實(shí)驗(yàn)以農(nóng)桿菌EHA105為參照菌株，對(duì)農(nóng)桿菌AGL-1介導(dǎo)轉(zhuǎn)化銀耳進(jìn)行研究?；谵r(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因受諸多因素的影響，本實(shí)驗(yàn)從農(nóng)桿菌與銀耳芽孢共培養(yǎng)時(shí)間、銀耳芽孢濃度、農(nóng)桿菌濃度、誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS)的濃度、轉(zhuǎn)率等方面進(jìn)行優(yōu)化。其轉(zhuǎn)化前提優(yōu)化結(jié)果為：AGL-1菌液OD值為0.4～0.5，AS誘導(dǎo)培養(yǎng)濃度為250μg/mL、共培養(yǎng)濃度為150μ耳芽孢濃度為10~8/mL，共培養(yǎng)72h轉(zhuǎn)化率zui高，可達(dá)500個(gè)/10~8，且陽(yáng)性菌落為89%；EHA105菌液OD值為0.4～0.5。

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