一、產(chǎn)品及特點(diǎn)：
本試劑盒提供合成cDNA*鏈所需要的全部試劑。其原理是用突變的莫洛尼氏鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（M-MuLV RT）合成mRNA的全長(zhǎng)cDNA拷貝。
1.使用突變的反轉(zhuǎn)錄酶，內(nèi)源RNase H活性低。
2.zui長(zhǎng)可合成13 Kb的cDNA。
3.可以使用oligo-dT、隨機(jī)引物和RNA專一性引物三種引物（前兩種本試劑盒提供）。
4.總RNA、poly(A)+RNA或特殊RNA均可作為模板。
5.可用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建、RT-PCR、探針標(biāo)記等。
規(guī)格及成分 成 份 編號(hào) 10次包裝 50次包裝
MMLV（含RI） 60906A 20 uL 100 uL
RT Buffer（含dNTP） 60906B 60 uL 300 uL
Oligo (dT)18引物(0.5 ug/uL) 100814 10 uL 50 uL
Random Primer(0.2 ug/uL) 100409 10 uL 50 uL
RNase-free水 80403 1 mL 1 mL
使用手冊(cè) 1份 1份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。
二、使用方法
合成PCR用的1st-strand cDNA
1.按下表配制RT反應(yīng)體系:
RNA模板
總RNA 100-500 ng
或poly(A) mRNA 10-500 ng
或?qū)Ｒ坏腞NA 0.01 pg-500 ng
注意：RNA樣品不能含有基因組DNA污染。
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或隨機(jī)引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或RNA模板專一性引物 15-20 pmol
注意：隨機(jī)引物與RNA模板的比例跟cDNA合成的平均長(zhǎng)度成反比。
RNase-free水 補(bǔ)水到13 uL
2.70℃保溫5分鐘后立即冰浴。
3.再加入5 uL RT Buffer（含dNTP）。
4.37℃保溫5分鐘。對(duì)富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的高GC RNA 模板，可以改成45℃保溫5分鐘。如果使用隨機(jī)引物，則改成25℃ 5分鐘。
5.加入2 uL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（含RI），反應(yīng)終體積為20 uL。
6.42℃保溫60分鐘（但如果使用隨機(jī)引物，需要先25℃保溫10分鐘，然后再轉(zhuǎn)移到42℃保溫60分鐘）。此步為RT反應(yīng)。
7.70℃保溫10分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作為PCR模板使用，不需要純化。
合成建文庫(kù)用的1st-strand cDNA
1.按下表配制RT反應(yīng)體系:
RNA模板
poly(A) mRNA 1 ug
或?qū)Ｒ坏腞NA 0.5-1 ug
注意：RNA樣品不能含有基因組DNA污染。
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或隨機(jī)引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或RNA模板專一性引物 100 pmol
注意：隨機(jī)引物于RNA模板的比例跟cDNA合成的平均長(zhǎng)度成反比。
RNase-free水 補(bǔ)水到13 uL
2.70℃保溫5分鐘后立即冰浴。
3.再加入5 uL RT Buffer（含dNTP）。
4.37℃保溫5分鐘。對(duì)富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的高GC RNA 模板，可以改成45℃保溫5分鐘。如果使用隨機(jī)引物，則改成25℃ 5分鐘）。
5.加入2 uL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（含RI），反應(yīng)終體積為20uL。
6.42℃保溫60分鐘（但如果使用隨機(jī)引物，需要先25℃保溫10分鐘，然后再轉(zhuǎn)移到42℃保溫60分鐘）。此步為RT反應(yīng)。
7.70℃保溫10分鐘以終止反應(yīng)，放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二鏈cDNA的合成或放置在-20℃*保存。
三：用對(duì)照模板合成cDNA(需要用同位素，需要對(duì)照的客戶需要單獨(dú)跟天澤基因)
1.按下表配制RT反應(yīng)體系:
對(duì)照RNA模板(0.5 ug/uL) 2 uL
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或隨機(jī)引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或?qū)φ找?/span> 2 uL
RNase-free水 補(bǔ)水到13 uL
2.70℃保溫5分鐘后立即冰浴。
3.再加入5 uL RT Buffer（含標(biāo)記dNTP，本試劑不提供）。
4.37℃保溫5分鐘。如果使用隨機(jī)引物，則保溫溫度只能是25℃。
5.加入2 uL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（含RI），反應(yīng)終體積為20uL。
6.42℃保溫60分鐘（但如果使用隨機(jī)引物，需要先25℃保溫10分鐘，然后再轉(zhuǎn)移到42℃保溫60分鐘）。
7.加1uL 0.5M EDTA，放置在冰上待用。
8.電泳檢測(cè)。合成的cDNA的量一般有加入RNA總量的50%以上，電泳一般能出現(xiàn)1.1Kb的片段（如果使用隨機(jī)引物，將出現(xiàn)多個(gè)小片段）。
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