方法一、改良異硫氰酸胍提取法

試劑及其配制

異硫氰酸胍變性液：

貯存液-在含484ml 水(經(jīng)DEPC處理), 17.6ml 0.75mol/L檸檬酸鈉(pH7.0)和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g異硫氰酸胍，加熱至60~65℃并持續(xù)攪拌使之充分溶解。貯存液室溫保存?zhèn)溆?不超過3個(gè)月)。

工作液-在每50ml貯存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室溫下保存不超過1個(gè)月。工作液各成分的終濃度為：

4mol/L異硫氰酸胍

25mol/L檸檬酸鈉pH 7.0

0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)

0.1mol/L巰基乙醇(2-ME)

其它溶液：

2mol/L乙酸鈉 (NaAc) 緩沖液 (pH 4.0)

水飽和酚(pH 3.5)

49∶1 (v/v) 氯仿/異戊醇

異丙醇

70%乙醇(用DEPC處理水配制)

DEPC處理后高壓滅菌水

試驗(yàn)程序

1.取0.5~1g左右新鮮植物組織置于研缽中，加入液氮，迅速研磨成均勻的粉末。

2.將粉末全部移入冰上預(yù)冷的離心管中，并向其中加入5ml異硫氰酸胍變性液，輕輕搖動(dòng)離心管使混合均勻。

3.順序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水飽和苯酚5ml、氯仿/異戊醇1ml，每加入一種試劑都輕輕搖動(dòng)離心管混合均勻，zui后將離心管蓋緊，倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴15min.。

4.4℃條件下15000g離心30min.，將上層水相轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于-20℃冰箱冷凍1h.。

5.4℃條件下13000g離心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml異硫酸胍變型液中(體積為*次變性液的1/3)，再加入等體積的異丙醇，混勻后置于-20℃冰箱冷凍1h.。

6.4℃條件下13000g離心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于適量體積(50μg/100μl)的DEPC處理水中，檢測(cè)后分裝，置于-70℃低溫條件下保存。

注意事項(xiàng)

RNA提取過程中，為了保證所提取的RNA的純度和完整性，其中有兩個(gè)方面的問題需要特別控制，一是去除與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，二避免內(nèi)外源Rnase對(duì)RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白質(zhì)變性劑有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉(SDS)等。為防止外源Rnase的污染，所有試驗(yàn)用品均需用DEPC處理并高壓滅菌，所有試劑配制均需使用經(jīng)DEPC處理過的水或滅菌處理。內(nèi)源RNase的抑制采用異硫氰酸胍等強(qiáng)還原劑。為避免人體污染，所有試驗(yàn)操作均應(yīng)帶手套，避免人體接觸所有用品。

方法二、改良Krapp提取法

試劑及其配制

RNA抽提掖：

母液：4mol 異硫氰酸胍

20mmol EDTA

20mmol MES

pH 7.0

工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME貯存在4℃條件下備用。

RNA重懸液：2mol LiCl

10mmol NaAc

調(diào)整終體積為250ml，pH 5.2，滅菌后貯存在4℃條件下備用。

試驗(yàn)程序

1. 取新鮮植物材料0.5~1g，冷凍干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混勻。

2.4℃條件下8000rpm離心10min.，將上層水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入等體積的酚/氯仿抽提掖，在4℃條件下8000rpm離心10min.。

3.上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次(加入10ml氯仿充分混勻后，在4℃條件下8000rpm離心10min.)。

4.小心將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷無水乙醇，在-80℃條件下沉淀2小時(shí)。

5.在4℃條件下8500rpm離心30min.，小心棄去上清液，沉淀重懸于RNA重懸液中，置于4℃條件下1小時(shí)。

6.4℃條件下8500rpm離心10min.，棄去上清液，沉淀溶于適當(dāng)體積的DEOC處理水中。檢測(cè)后分裝，置于-70℃條件下保存。

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