1)訓(xùn)練目的

    掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的無(wú)菌操作技術(shù)；為后續(xù)實(shí)驗(yàn)如細(xì)胞傳代培養(yǎng)、細(xì)胞純化和冷凍保存等實(shí)驗(yàn)提供材料；掌握細(xì)胞原代培養(yǎng)中常用的組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法的操作要領(lǐng)。

2)實(shí)驗(yàn)材料

①材料：妊娠10一14 d的小鼠。

②試劑：75％乙醇、Hank’s液、DMEM培養(yǎng)液(含10％FBS和抗生素)、1份0．25％*加1份0．02％乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)。

③器材：超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、高壓滅菌鍋、電熱干燥箱、酒精坷、分析天平、吸管彎頭和直頭和膠帽、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、燒杯(100 mL)、*、*、鑷子、解剖盤、不銹鋼篩(100目)、離心管(10 mL)、計(jì)數(shù)板。

3)操作步驟

(1)組織塊培養(yǎng)法

①取材：將妊娠10一14 d的小鼠用引頸處死，然后將其整個(gè)浸入盛有75％乙醇的燒杯中5 s，取出后放入已經(jīng)消毒的腎形解剖盤中，用普通*、*在動(dòng)物軀干中部環(huán)形切開皮膚，并將兩側(cè)皮膚分別拉向頭尾把動(dòng)物反包，暴露軀干。用眼科剪、*切開動(dòng)物腹肌和腹膜，并取出含有胎兒的兩側(cè)子宮放入60 min培養(yǎng)皿中，剖開子宮體，取出胎兒，在Hanks's液體內(nèi)洗去血液、羊水、胎膜等雜物后放入另一培養(yǎng)皿。

②剪切：去除胎兒頭、尾及內(nèi)臟，只留下胎兒四肢及軀干部分，在Hank's液內(nèi)洗2～3次去除血污后，放人60 mm培養(yǎng)皿或*小瓶?jī)?nèi)，用眼科剪、*反復(fù)將小鼠胎兒剪切成1 mm3的小塊。

③接種：用彎頭吸管吸取若干組織小塊，置于培養(yǎng)瓶中；用吸管彎頭把組織小塊接種到培養(yǎng)瓶底上，小塊相互距離5 min為宜，每25 mL培養(yǎng)瓶可接種20～30塊。

④黏附培養(yǎng)：組織塊放置好后，吸凈培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使接種組織塊的瓶底向上。注意翻轉(zhuǎn)瓶時(shí)勿使組織塊流動(dòng)，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)2—4 h，使組織塊微干并黏著在培養(yǎng)瓶底上。

⑤培養(yǎng)：從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，開蓋，瓶底向上，從瓶底角部加入1 mL*DMEM培養(yǎng)液；然后緩慢 翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附著于培養(yǎng)瓶底的組織小塊，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量較多時(shí)，再補(bǔ)加培養(yǎng)液至約3 mL。

    在翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶和加液過(guò)程中，嚴(yán)禁動(dòng)作過(guò)快產(chǎn)生沖力，使黏附的組織塊漂起而造成原代培養(yǎng)失敗。若組織塊不易貼壁，可預(yù)先在瓶壁涂上薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。

    組織塊培養(yǎng)也可以不用翻轉(zhuǎn)法，即在接種組織塊后，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)僅加入少量培養(yǎng)液，能保持組織塊濕潤(rùn)即可。蓋好瓶蓋，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h再補(bǔ)加培養(yǎng)液。

(2)消化培養(yǎng)法

①取材與剪切：同組織塊培養(yǎng)法：

②消化：將剪切后的組織小塊移入10 mL離心管內(nèi)，加入2 mL的O 25％*+0.02％EDTA組成的消化液，室溫下消化15～20 min，期間用吸管吹打數(shù)次，并隨時(shí)吸取少量消化液在顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞。則立即加入8 mL含5％FBs的Hank’s液終止消化。

③用吸管反復(fù)吹打組織塊，分散單細(xì)胞，用100目不銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾，收取濾出液，2 000 r／min離心5 min，棄上清液。

④用Hank，。液重懸細(xì)胞，2 000 r／min離心5 min后棄上清液；重復(fù)漂洗兩次，以去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片等。

⑤用2 mLDMEM+10％FBS培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)并稀釋細(xì)胞濃度至(1～5)×106個(gè)／mL，加細(xì)胞懸液入培養(yǎng)瓶。置37℃、5％C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24 h后，更換新培養(yǎng)液，此后每3 d換液1次。

4)注意事項(xiàng)

①消化培養(yǎng)法效率較高，可得到大量的原代細(xì)胞用于培養(yǎng)，但操作步驟較多，操作時(shí)要特別注意，以防微生物污染而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。

②對(duì)于不同的組織需用不同的消化方法，一般而言，胚胎類軟組織用*或EDTA即可得到理想的消化效果，而對(duì)于成體組織由于存在大量的細(xì)胞外基質(zhì)，需用膠原酶，有時(shí)配合使用半透明質(zhì)酸酶會(huì)加速消化過(guò)程。

③在組織消化過(guò)程中要隨時(shí)取樣進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞時(shí)應(yīng)立即終止消化，以免消化過(guò)度影響細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)。

④細(xì)胞接種濃度不宜過(guò)大，否則會(huì)影響貼壁和細(xì)胞生長(zhǎng)。