免疫組化試劑的標(biāo)準化

    要求試劑公司提供標(biāo)準化的試劑，并附詳細的試劑說明書，包括抗體的來源、免疫球蛋白的亞類、單抗或多抗、使用稀釋度、使用流程和注意事項、洗滌時緩沖液的適宜離子強度和PH值等?？贵w的選擇是開展免疫組化zui重要環(huán)節(jié)之一。目前，抗體大部分來源于國外，抗體種類繁多，生產(chǎn)廠家各異，再經(jīng)過中介渠道致有效期縮短，影響抗體效價甚至陽性不表達，因此對購入的抗體首先要進行檢測。理想的抗體應(yīng)具備特異性強、敏感性高和適應(yīng)性強的特點。

    現(xiàn)實市場銷售的一抗多為即用型，對抗體的滴度無須摸索，但對于濃縮型一抗，則應(yīng)摸索出*的工作滴度，抗體的濃度過高或過低都將可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，應(yīng)該用一個適當(dāng)?shù)南♂尪鹊玫?的抗原染色強度和zui低的背景著色。靈敏度高而極易控制背景的檢測系統(tǒng)試劑盒是zui為理想也是免疫組化染色優(yōu)劣的關(guān)鍵，根據(jù)免疫組化技術(shù)發(fā)展至今第三代SP試劑盒更優(yōu)于其它試劑盒 (ABC、PAP等)。但應(yīng)注意檢測系統(tǒng)應(yīng)與一抗來源相匹配，否則檢不出目的物。一抗的作用時間是4℃過夜，也可以用37℃*lh，但后者在染色過程中應(yīng)控制好溫度、時間及其它抗體稀釋度。

（1）抗體選用：一般來講，多克隆抗體的抗原專一性較差，非特異性反應(yīng)較明顯，效價不太穩(wěn)定；但多克隆抗體制備簡便，價格低廉，抗體效價較高，稀釋度一般在1∶100~1000之間，適應(yīng)性強，有部分多抗表達抗原特異性較好，如TG和PSA等，多抗CD3對石蠟切片標(biāo)記T細胞適應(yīng)性強，陽性率高。單克隆抗體的抗原專一性強，質(zhì)量和效價穩(wěn)定，非特異性反應(yīng)較少，標(biāo)記結(jié)果可靠，但單克隆抗體制備復(fù)雜，價格昂貴，抗體效價較低，稀釋度在1∶50~100，如單抗CD3只能在冷凍切片上表達，難在石蠟切片顯色。目前市場上常有分裝、稀釋抗體出售，這種抗體有使用經(jīng)濟的優(yōu)點，但稀釋抗體減少了蛋白分子間互相保護的作用，因而效價不穩(wěn)定，不易長期保存。進口試劑質(zhì)量較好，但價格昂貴，特別是常用的第二抗體，染色過程短，敏感性高。因此，應(yīng)根據(jù)實際需要選擇合適的抗體。

（2）抗體分裝：購入的抗體（除非只夠數(shù)次用量）一般需要分裝在多個安瓿中，根據(jù)月需要量，大致每安瓿含5~20微升。除留下一支現(xiàn)用，其余應(yīng)立即放置低溫冰箱內(nèi)貯存（-20℃以下）。用一支取一支，以免長期保存在4℃冰箱內(nèi)失效。

（3）抗體稀釋：抗體使用一般按其工作濃度稀釋，如1∶100，1∶1000等等。一次用不完的抗體可保存在4 ℃冰箱內(nèi)，盡量在1~2月內(nèi)用完，而不要放在4 ℃冰箱的冰格中，因為溫度在0 ℃以下，抗體會很快結(jié)冰，再次使用時又要融化，這樣幾次凍融，抗體效價會急劇下降而失效。用作抗體的稀釋液，在夏天溫度很高時，加入少許防腐劑如疊氮鈉、柳硫汞等，以免在切片上作用時間超過10小時而生霉菌。

（4）無菌與消：保持使用中的抗體無菌是困難的，但是與抗體接觸的工具如滴管、吸管、試管、安瓿以及加樣器等經(jīng)過消毒，盡量減少污染的機會，不然抗體極易污染細菌與霉菌，而迅速發(fā)生渾濁沉淀而失效。