1．準(zhǔn)備好凝膠濾柱以便完成結(jié)合反應(yīng)后用于分離標(biāo)記抗體和游離的熒光色素。分離球形蛋白使用排除極限為20 000～50 000的凝膠介質(zhì)和細(xì)粒級(jí)凝膠（直徑約50μm）。所需凝膠濾柱的大小可根據(jù)偶聯(lián)反應(yīng)的總體積×20來確定。依據(jù)廠家說明準(zhǔn)備好濾柱，用20倍柱床體積的PBS灌注濾柱，直至緩沖液水平剛好降至低于柱床頂部，關(guān)閉濾紙底部的閥門或用塑膜黏土（或parafilm）封閉底端以使濾柱不再流動(dòng)。

2．用0.1mol/L的硼酸鈉或碳酸鈉配制濃度至少為2mg/ml的抗體溶液（pH9.0）。應(yīng)避免引入含一級(jí)胺的外來分子。

3．用無水DMSO（優(yōu)級(jí)純）溶解FITC或TRITC至1mg/ml。每次標(biāo)記反應(yīng)時(shí)新鮮配制。

4．每1ml蛋白溶液加50μl染液。染液須以每次5μl緩慢加入，加入時(shí)應(yīng)輕輕地連續(xù)攪拌混勻。

5．置4℃避光反應(yīng)1h。

6．加氯化銨至50mmol/L，室溫孵育2h。加入0.1％二甲苯氰和5％甘油。

7．通過凝膠過濾分離結(jié)合物與未結(jié)合的染料。小心地將偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物加在濾柱頂部，打開閥門使抗體溶液流過濾柱直至剛好進(jìn)入柱床。再小心地將PBS加在濾柱頂部并與緩沖液供應(yīng)裝置連接。結(jié)合染料的抗體首先洗脫，通?？稍谑夜庀乱姷?。

8．將洗脫液的結(jié)合物4℃貯存于避光容器，必要時(shí)加入0.02％疊氮鈉。

9．進(jìn)行熒光素偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，應(yīng)通過測(cè)量495nm和280nm波長(zhǎng)的吸光值計(jì)算熒光素和蛋白的比率，羅丹明的測(cè)量波長(zhǎng)在550nm和280nm。熒光素的吸光值比例（496nm/280nm）應(yīng)在0.3～1.0之間，羅丹明的吸光值比率（550nm/280nm）在0.3～0.7之間。低于上述比率將導(dǎo)致低信號(hào)，高比率則出現(xiàn)高背景。若比率太低，應(yīng)使用低濃度抗體與高濃度染料重復(fù)結(jié)合；若比率太高，則可適當(dāng)調(diào)整后重新標(biāo)記，或通過DEAE離子交換層析柱進(jìn)一步純化抗體。用10mmol/L 磷酸鉀（pH8.0）平衡并灌注濾柱，通過增加鹽濃度進(jìn)行梯度洗脫。