支原體污染檢測(cè)試劑盒(PCR法)
(PCR Mycoplasma Detection Kit)
Cat number：YS012
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For Research Use Only
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支原體污染檢測(cè)試劑盒(PCR法)一、試劑盒說(shuō)明
本試劑盒通過(guò)PCR 法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物、動(dòng)物分泌物等多種生物材料進(jìn)行支原體污染檢測(cè)。常
規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行支原體檢測(cè)一般需要幾天的時(shí)間，而本試劑盒通過(guò)PCR 擴(kuò)增及電泳分析進(jìn)行
支原體檢測(cè)只需幾個(gè)小時(shí)，方便快捷。本試劑盒的多對(duì)引物能特異性擴(kuò)增多種支原體rRNA
基因片段，一次就可以檢測(cè)至少11 種的支原體，包括M. fermentans，M. hyorhinis，M. arginini，
M. orale ， M. salivarium ， M. hominis ， M. pulmonis ， M. arthritidis, M. neurolyticum, M.
hyponeumoniae, M. capricolum 等。其原理是原核生物的rRNA 堿基序列非常保守，而rRNA
操縱子上編碼rRNA 的DNA 間隔區(qū)如16S 和23S 間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列差別很
大。這個(gè)間隔區(qū)的DNA 序列及長(zhǎng)度在支原體各個(gè)種間既有相對(duì)保守的部分，也有具有很大
差異的部分。因此可以在編碼16S 和23S rRNA 的DNA 上設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增編碼16S 和
23S rRNA 的DNA 間隔區(qū)，然后在編碼16S 和23S rRNA 的DNA 間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計(jì)一
條引物，在編碼23S rRNA 的DNA 上設(shè)計(jì)一條引物進(jìn)行嵌套式PCR。能特異性檢測(cè)出支原
體DNA，檢測(cè)靈敏度與特異性都很高。
支原體污染檢測(cè)試劑盒(PCR法)二、試劑盒組份
組份YS012(20 assays) 儲(chǔ)存條件
10×Taq Buffer(不含Mg2＋) 1.0 mL -20℃
MgCl2(25mM) 1.0 mL -20℃
Taq DNA Polymerase(5 U /μl) 100 U -20℃
Myc F1 Primer (10μM) 50μL -20℃
Myc R1 Primer(10μM) 50μL -20℃
Myc F2 Primer(10μM) 50μL -20℃
Myc R2 Primer(10μM) 50μL -20℃
Control Template(1 ng/μl) 50μL -20℃
DNA 溶解液2 mL -20℃
ddH2O 5 mL -20℃
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
離心機(jī)、微量移液器、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀、dNTPs(10mM)、瓊脂糖、溴化乙錠
等
四、使用注意事項(xiàng)
整個(gè)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)規(guī)范操作，反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣、PCR 擴(kuò)增應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，以
避免交叉污染。
支原體污染檢測(cè)試劑盒(PCR法)五、操作方法
1.收取待檢樣品(細(xì)胞一般生長(zhǎng)至80％左右即可，貼壁細(xì)胞不宜用消化液消化細(xì)胞，可以使
用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞)，然后取細(xì)胞懸液200ul(約1～3×105 細(xì)胞數(shù))至離心管，12000rpm 離心
5～10min；去上清，加入50ul DNA 溶解液，充分懸浮沉淀物，沸水浴5min；樣品使用前
12000rpm 離心5～10min，取上清4ul 作為PCR 反應(yīng)模板；剩余樣品可以-20℃保藏。樣本
有時(shí)也可以直接用污染液直接做PCR 反應(yīng)。
2.PCR 反應(yīng)
*步PCR：
50μL 體系PCR 反應(yīng)(如客戶需要使用更小量的反應(yīng)體系，試劑加樣量按比例進(jìn)行減少)：
(1)．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm 離心20s；
(2)．取滅過(guò)菌的0.2mL 離心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs (10mM) 1 μL
MgCl2 (25mM) 4 μL
Myc F1 (10μM) 1 μL
Myc R1 (10μM) 1 μL
DNA 樣品1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
(3)．輕輕混勻，2000rpm 離心20s；
(4)．進(jìn)行PCR 擴(kuò)增
PCR 擴(kuò)增條件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
72°C，10 min，
第二步PCR：
50μL 體系PCR 反應(yīng)(如客戶需要使用更小量的反應(yīng)體系，試劑加樣量按比例進(jìn)行減少)：
(1)．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm 離心20s；
(2)．取滅過(guò)菌的0.2mL 離心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs (10mM) 1 μL
MgCl2 (25mM) 4 μL
Myc F2 (10μM) 1 μL
Myc R2 (10μM) 1 μL
*步產(chǎn)物1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
(3)．輕輕混勻，2000rpm 離心20s；
(4)．進(jìn)行PCR 擴(kuò)增
PCR 擴(kuò)增條件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
72°C，10 min，
3.反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液10μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR 反應(yīng)產(chǎn)物。如果此PCR 產(chǎn)
物需用于以后實(shí)驗(yàn)，應(yīng)將PCR 產(chǎn)物冷凍保存。
4.根據(jù)感染支原體類型的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物大小有所不同，*步PCR 產(chǎn)物在350～700bp 之
間，第二步PCR 產(chǎn)物在150～250bp 之間。支原體污染檢測(cè)試劑盒(PCR法)
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