實(shí)驗(yàn)方法原理
本實(shí)驗(yàn)以酵母RNA 為材料, 將RNA 用堿水解成單核苷酸,再用離子交換柱層析進(jìn)行分離, zui后采用紫外吸收法進(jìn)行鑒定。同時(shí)通過(guò)測(cè)定各單核苷酸的含量, 可以計(jì)算出酵母RNA 的堿基組成。
實(shí)驗(yàn)材料 酵母RNA
試劑、試劑盒 陰離子交換樹(shù)脂聚苯乙烯-二乙烯苯-*胺季銨甲酸甲酸鈉KOH蒸餾水過(guò)氯酸NaOHHClAgNO3
儀器、耗材 層析柱梯度洗脫器電磁攪拌器恒流泵自動(dòng)部分收集器酸度計(jì)紫外分光光度計(jì)旋渦混合器核酸蛋白檢測(cè)儀臺(tái)式離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. RNA 的堿水解
稱(chēng)取20 mg 酵母RNA, 置于刻度離心試管中, 加2ml 新配 制的0 . 3 mol/ L KOH, 用細(xì)玻璃棒攪拌溶解, 于37 ℃ 水浴中保 溫水解20 h。然后用2 mol/ L HClO4 ( 過(guò)氯酸) 調(diào)水解液pH 至2 以下( 要少量多次, 只需幾滴即可) 。由于核苷酸在過(guò)酸的條件 下易脫嘌呤, 所以滴加HClO4 時(shí)需用旋渦混合器迅速攪拌, 防 止局部過(guò)酸, 再以4000 r/ min 的轉(zhuǎn)速離心15 min , 置冰浴中 10 min , 以沉淀*。將上清液倒入另一刻度試管中, 用2 mol/ L NaOH 逐滴將上清液pH 值調(diào)至8～9 , 作上樣樣品液備用。樣品 液上柱前, 取0 . 1 ml 稀釋500 倍, 測(cè)定其在260 nm 波長(zhǎng)處的光 吸收值, 用以zui后計(jì)算離子交換柱層析的回收率。
2. 離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理
取201×8 粉末型強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂8 克(濕) , 先用蒸 餾水浸泡2 h , 浮選除去細(xì)小顆粒, 同時(shí)用減壓法除去樹(shù)脂中存 留的氣泡, 然后用四倍樹(shù)脂量的0 . 5 mol/ L NaOH 溶液浸泡1 h , 除去樹(shù)脂中的堿溶性雜質(zhì)。用去離子水洗至近中性后, 再用四倍 量1 mol/ L HCl 浸泡半小時(shí), 以除去樹(shù)脂中酸溶性雜質(zhì)。接著用 蒸餾水洗至中性( 可以上柱洗) , 此時(shí)陰離子交換樹(shù)脂為氯型。
3. 離子交換層析柱的裝柱方法
離子交換層析柱可使用內(nèi)徑約1 cm、長(zhǎng)10 cm 的層析柱, 柱 下端有燒結(jié)上的垂熔濾板, 柱上端使用橡皮塞, 塞子中間打一小 孔。緊緊插入一根細(xì)聚乙烯管, 層析柱夾在鐵架臺(tái)上, 調(diào)成垂 直, 柱下端細(xì)膠管用螺旋夾夾緊, 向柱內(nèi)加入蒸餾水至2/ 3 柱 高, 再用滴管將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的離子交換樹(shù)脂加入柱內(nèi), 使樹(shù)脂自 由沉降至柱底, 放松螺旋夾, 使蒸餾水緩慢流出, 再繼續(xù)加入樹(shù) 脂, 使樹(shù)脂zui后沉降的高度約為6～7 cm .。注意在裝柱和以后使 用層析柱的過(guò)程中, 切勿干柱, 樹(shù)脂不能分層, 樹(shù)脂面以上要保 持一定高度的液面(不能太高, 約1 cm) , 以防氣泡進(jìn)入樹(shù)脂內(nèi) 部, 影響分離效果。
4. 樹(shù)脂的轉(zhuǎn)型處理
樹(shù)脂的轉(zhuǎn)型處理就是使樹(shù)脂帶上洗脫時(shí)所需要的離子。本實(shí) 驗(yàn)需要將陰離子交換樹(shù)脂由氯型轉(zhuǎn)變?yōu)榧姿嵝汀Ｏ扔?00 ml 1 mol/ L 甲酸鈉洗柱, 用1% AgNO3 檢查柱流出液, 直至不出現(xiàn) 白色AgCl 沉淀為止。然后改用約200 ml 0 . 2 mol/ L 甲酸繼續(xù)洗 柱, 測(cè)定流出液的A260 ≤ 0 . 020 為止。zui后用蒸餾水洗柱, 直至 流出液的pH 值接近中性(或與蒸餾水的pH 相同) 。
5. 加入樣品并淋洗除去不被樹(shù)脂吸附的組分
加樣就是將RNA 堿水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到離子交換層析柱內(nèi), 使 其被離子交換樹(shù)脂吸附。先將柱內(nèi)液體用滴管輕輕吸去, 使液面 下降到剛接近樹(shù)脂表面。旋緊下端螺旋夾, 用滴管準(zhǔn)確移取1 . 0 ml RNA 堿水解樣品液, 沿柱壁小心加到樹(shù)脂表面, 然后松開(kāi)下 端螺旋夾, 使樣品液面下降至樹(shù)脂表面, 接著用滴管加入少量蒸 餾水, 當(dāng)水面降至樹(shù)脂表面時(shí), 再用約200 ml 蒸餾水洗柱, 將不 被陰離子交換樹(shù)脂吸附的嘌呤及嘧啶堿基、核苷等雜質(zhì)洗下來(lái)。 檢查流出液在260 nm 波長(zhǎng)處的吸光度, 直至低于0 . 020 為止。 關(guān)恒流泵, 旋緊柱下端螺旋夾。
6. 梯度洗脫
在梯度洗脫器的混合瓶?jī)?nèi)加入300 ml 蒸餾水, 貯液瓶中加入 300 ml 0 . 20 mol/ L 甲酸-0 . 20 mol/ L 甲酸鈉混合液(注意: 梯度洗 脫器底部的連通管要事先充滿蒸餾水, 趕盡氣泡)。洗脫器出口 與恒流泵入口用細(xì)塑料管相連, 打開(kāi)兩瓶之間的連通閥和出口 閥, 打開(kāi)電磁攪拌器, 松開(kāi)柱下端螺旋夾, 開(kāi)啟恒流泵, 控制 流速為5 ml / 管/ 10 分, 開(kāi)啟部分收集器, 分管收集流出液。 以蒸餾水為對(duì)照, 測(cè)定各管在260 nm 波長(zhǎng)下的A260 值, 給各管 編號(hào), 并標(biāo)出zui高峰的收集管。
7. 核苷酸的鑒定
分別測(cè)定zui高峰管內(nèi)液體在230～300 nm 之間, 每相差5 nm 間隔的光吸收值。其中包括有250 nm、260 nm、280 nm, 290 nm 各點(diǎn)( 注意: 液體均要保留, 切勿倒掉。測(cè)量時(shí)用石英杯)。由 于在小于250 nm 時(shí), 甲酸( HCOOH ) 具有很強(qiáng)的光吸收值, 因此測(cè)定時(shí)所用參比對(duì)照液近似為: *個(gè)峰用0 . 05 mol/ L 甲酸-0 . 05 mol/ L 甲酸鈉。 第二個(gè)峰用0 . 10 mol/ L 甲酸-0 . 10 mol/ L 甲酸鈉。 第三個(gè)峰用0 . 15 mol/ L 甲酸-0 . 15 mol/ L 甲酸鈉。 第四、五兩峰用0 . 20 mol/ L 甲酸或0 . 20 mol/ L 甲酸鈉。 也可以根據(jù)zui高峰所在位置, 計(jì)算甲酸、甲酸鈉的濃度選擇 參比液。
8. 測(cè)定各種核苷酸的含量和總回收率
分別合并(包括zui高峰管在內(nèi)) 各組分洗脫峰管內(nèi)的洗脫 液, 用量筒測(cè)出溶液總體積, 然后測(cè)定其A260 值, 參比對(duì)照液同 上。根據(jù)層析柱上樣液的A260 值以及層析后所得到的各組分A260 值之和, 可以計(jì)算出離子交換柱層析的回收率( 注: RNA 的摩 爾消光系數(shù)E260 為7 . 7×103 ～7 . 8×103 , 水解后增值40%) 。
9. 樹(shù)脂的再生
使用過(guò)的離子交換樹(shù)脂經(jīng)過(guò)再生處理后, 可重復(fù)使用?？梢?在柱內(nèi)處理, 也可以將樹(shù)脂取出后處理。取出樹(shù)脂的方法是用橡 皮球由層析柱的下端向柱內(nèi)吹氣, 用燒杯收集流出的樹(shù)脂。樹(shù)脂 再生的方法與未使用的新樹(shù)脂預(yù)處理方法相同。也可以直接用 1 mol/ L NaCl 溶液浸泡或洗滌, zui后用蒸餾水洗至流出液的pH 值接近中性。
【結(jié)果處理】
1. 作出陰離子交換樹(shù)脂柱層析分離核苷酸的洗脫曲線, 以 層析流出液管數(shù)(或體積) 為橫坐標(biāo), 以相應(yīng)的A260 值為縱坐 標(biāo), 作出洗脫曲線圖。
2. 作出各單核苷酸的紫外吸收光譜圖, 根據(jù)各組分溶液在 230～300 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光值, 以波長(zhǎng)( nm) 為橫坐標(biāo), 吸 光值為縱坐標(biāo), 作出它們的吸收光譜圖。由圖上求出每個(gè)單核苷 酸組分的zui大吸收峰的波長(zhǎng)值, 同時(shí), 計(jì)算出各個(gè)組分在不同波 長(zhǎng)的吸光值比值( 250/ 260 , 280/ 260 , 290/ 260) , 將它們與各核 苷酸的標(biāo)準(zhǔn)值列表比較, 從而鑒定出各組分為何種核苷酸。
3. 根據(jù)層析上樣液的A260 值, 以及層析后所得到的各組分 A260 值之和, 計(jì)算出離子交換柱層析的回收率。
會(huì)員1.png)