實驗方法原理 酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中zui常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶（如辣根過氧化物酶，簡稱HRP）國內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。
實驗材料 抗體
試劑、試劑盒 戊二醛液萘氏試劑PBSNaIO4碳酸鹽緩沖液醋酸鈉緩沖液NaBH4
儀器、耗材 攪拌器分光光度計離心機透析袋燒杯試管吸管
實驗步驟
一、酶制劑及其底物
凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶，原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求
1. 來源方便，易于純化；
2. 比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定；
3. 酶活性和量能用簡單方法測定。
目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶（HRP）和鹼性磷酸酶（AP），其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、*和蘋果酸脫氫酶等。
由于辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase， HRP）比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18 ％。HRP由多個同功酶組成，分子量為40000，等電點為PH3～9，酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58 ％以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403 nm和275 nm，一般以O(shè)D403 nm /OD275 nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右（zui高可達(dá)3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。
HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫（H2O2）和供氫體（DH2）。供氫體多為無色的還原型 染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料（D）。酶促反應(yīng)的過程如下
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點不一。如DAB（3，3－二氨基聯(lián)苯胺）的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S（5-氨基水楊酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT（鄰聯(lián)甲苯胺）的特點是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時間內(nèi)進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD（鄰苯二胺）和TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2，2'-邊氮基-雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰（說明H2O2已消耗殆盡）。這樣即使再延長時間也不會增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。
二、HRP標(biāo)記抗體的方法
酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。
1. 戊二醛二步法
（1）原理
戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。
（2）標(biāo)記步驟
①稱取HRP25 mg溶于1.25 ％戊二醛溶液中，于室溫靜置。
②反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1 ml/1 分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5 ml，則以PEG濃縮至5 ml。放置25 ml小燒杯中，緩慢攪拌。
③將待標(biāo)記的抗體12.5 mg用生理鹽水稀釋至5 ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
④用1 M PH9.5碳酸緩沖液0.25 ml，繼續(xù)攪拌3 小時。
⑤加0.2 M賴氨酸0.25 ml，混勻后，置室溫2 小時。
⑥在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4 ℃1 小時。
⑦3000 rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15 M PH7.4的PBS中。
⑧將上述溶液裝入透析袋中，對0.15 M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后（用萘氏試劑檢測），10000 rpm離心30 分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
（3）結(jié)果判定
①定性及效價滴定
用特異性抗原（或抗體）同酶標(biāo)記抗體（或抗免疫球蛋白抗體）作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。zui后以直接ELISA法（或在正式實驗系統(tǒng)里）對酶結(jié)合物進行滴定。
②定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定（光程1 cm）。
酶量（mg/ml）＝OD403 nm×0.4
IgG量（mg/ml）＝OD280 nm-OD403 nm×0.42×0.94×0.62
酶量（mg/ml） IgG量（mg/ml） 酶量
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
40000 160000 IgG量
③本法標(biāo)記步驟比較簡單，重復(fù)性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2～4 ％的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。
2. 簡易過碘酸鈉法
本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70 ％的HRP和Ig結(jié)合，99 ％的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前zui常用的方法。
（1）原理
經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH4（或乙醇胺）還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。
（2）標(biāo)記步驟
①稱取5 mgHRP溶解于1 ml蒸餾水中。
②于上液中加入0.2 ml新配的0.1 M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20 分鐘。
③將上述溶液裝入透析袋中，對1 mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4 ℃。
④加20 μl 0.2 M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10 mg IgG（抗體，或SPA5 mg）在1 ml 0.01 M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2 小時。
⑤加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液，混勻，再置4 ℃ 2 小時。
⑥將上述液裝入透析袋中，對0.15 M PH7.4 PBS透析，4 ℃。
其余步驟（純化）同戊二醛標(biāo)記步驟的⑥、⑦、⑧。
（3）結(jié)果判定
除標(biāo)記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量（mg/ml）＝（OD280 nm-OD403 nm×0.3）×0.62
收起
注意事項
1. 在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標(biāo)記的抗體也要活性高，效價高（zui低1∶16），純度高，親和力好，這是保證標(biāo)記物效價高，免疫活性好的首要條件。
2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴(yán)格掌握。所用試劑，（或必需）新鮮配制。如在戊二醛標(biāo)記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體（雜質(zhì)）。否則，影響標(biāo)記效果。
3. 室溫攪拌時須避光，室內(nèi)溫度一般在25 ℃為宜。標(biāo)記物每次透析前，須認(rèn)真檢查，防止漏液。
4. 濃的標(biāo)記物相當(dāng)穩(wěn)定，常加入30～40 ％甘油于-10 ℃下保存。4 ℃可保存1～2 年，但稀釋成1∶10，只能保存數(shù)周。已配制的使用液應(yīng)在12 小時內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。
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其他
一、工作濃度的選擇
在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因為酶標(biāo)記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。
1. 酶標(biāo)記抗體的滴定方法
將抗原（或抗體）物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標(biāo)抗體（或抗Ig抗體）與吸附在載體上的抗原（或抗體）起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標(biāo)記抗體的效價，或稱工作濃度。
2. 步驟
先將抗原（或抗體）用0.05 M PH9.6包被緩沖液稀釋為10 μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1 ml，4 ℃，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標(biāo)記抗體用1 ％BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600......（根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定），分別加入反應(yīng)孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1 ml，37 ℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1 ml，37 ℃10～30 分鐘。以2 M H2SO4 0.05 ml終止反應(yīng)。
3. 結(jié)果判定
主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以O(shè)D為縱座標(biāo)，結(jié)合物濃度為橫座標(biāo)，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率zui大時的酶標(biāo)抗體稀釋度，即為該標(biāo)記物的工作濃度。
4. 有關(guān)試驗的試劑及器材均見ELISA部分。
5. 要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實際應(yīng)用中的zui適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統(tǒng)中，因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進一步確定實際工作濃度（可采用方陣法），以達(dá)到zui適的實驗條件。
