本實(shí)驗(yàn)旨在對淫羊藿CO 超臨界流體萃取物 的研究中，建立準(zhǔn)確，快速，靈敏的質(zhì)量控制方法， 以期更有效的開發(fā)利用這一天然藥物資源。
1 儀器與試藥
1．1 儀器
DOINEX液相色譜儀(配有PDA一3000光電 二極管矩陣檢測器，P一3400A分析泵)，Chromeleon 色譜工作站；HA221—50—06型超臨界萃取裝置(江 蘇南通華安公司)；FA1004N型電子分析天平(上海 精密科學(xué)儀器有限有限公司)；KQ一100型超聲波清 洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1．2 試藥
淫羊藿苷對照品自中國藥品生物制品檢定所 購買；淫羊藿葉購自河南聚仁中藥飲片有限公司， 批號20091115；甲醇為色譜純；水為超純水；其它試 劑均為分析純；二氧化碳(99．95％)。
2 方法與結(jié)果
2．1 淫羊藿超臨界提取物的薄層色譜鑒別
2．1．1 供試品溶液的制備
取淫羊藿藥材粉末100 g裝于萃取釜，以cO：為 溶劑，設(shè)定萃取釜、解析釜的溫度分別為60℃、25℃， 壓力分別為30 MPa、6 MPa，進(jìn)行動態(tài)萃取2 h，得到 萃取物，制得供試品溶液備用。
2．1．2 淫羊藿苷對照品溶液I的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品10．0 mg于10 mL量 瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得1．0 mg·mL 的 對照品溶液I。
2．1．3 薄層鑒別
分別吸取上述供試品溶液、對照品溶液I，硅膠 H板上點(diǎn)樣，以氯仿一甲醇一甲酸為展開劑，1％三氯 化鋁乙醇溶液顯色，置紫外燈365 nm下檢視，供試 品溶液在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色 的斑點(diǎn)，說明樣品中含有淫羊藿苷成分。
2．2 淫羊藿超臨界提取物的液相色譜檢測
2．2．1 色譜條件
本文參照有關(guān)文獻(xiàn)嘲，制定如下色譜條件，色譜 柱：Hypersil ODS C18柱(250 mm~4．6 mm，5 m)，流動 相：流動相A(甲醇)和B(0．1％冰醋酸溶液)梯度洗脫 0 min，A 30％ ，B 70％ ；10 min，A 55％ ，B 45％ ；15 min，A 67％ ，B 33％ ；20 min，A 68％ ，B 32％ ；22 rain，A 75％ ， B 25％。流速：1 mL·min ；檢測波長：270 lqm；柱溫： 25 oC；進(jìn)樣量：20 IxL，色譜圖見圖1。
2．2．2 色譜系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)
按淫羊藿苷峰計(jì)算，色譜系統(tǒng)的理論塔板數(shù)為 48 784；淫羊藿苷與其相鄰的色譜峰的分離度大于 1．5，淫羊藿苷與相鄰的色譜峰可以*分離。 2．2．3 淫羊藿苷對照品儲備液Ⅱ的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品10．6mg，置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為 1．06 mg·mL 的對照品儲備液Ⅱ。
2．2．4 線性關(guān)系考察
精密吸取對照品儲備液Ⅱ0．1，0．2，0．4，0．6，0．8， 1．0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。 按色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐 標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：Y=48．838X+ 3．467 8，r=0．999 1。結(jié)果：淫羊藿苷在0．212—2．12 Ixg 進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2．2．5 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
樣品溶液室溫放置，于8 h內(nèi)每間隔2 h測定淫 羊藿苷的含量，RSD為0．99％，說明樣品溶液在8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。
2．2．6 精密度實(shí)驗(yàn)
按色譜條件測定，對0．010 6、0．063 6、0．106 mg·mL 3個(gè)質(zhì)量濃度分別進(jìn)樣3針，量取峰面 積，計(jì)算RSD。高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的RSD分 別為1．17％、1．92％、1．59％。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，測定 方法的RSD值不大于1．92％。
2．2．7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
取同一批淫羊藿藥材，按“2．1．1”項(xiàng)下方法，平行制 備6份供試品溶液，分別測定含量。淫羊藿苷含量測定 結(jié)果的RSD為2．22％，表明分析方法重復(fù)性良好。
2．2．8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)
精密稱取同一批號已知含量的樣品6份，分別 按其中淫羊藿苷含量的80％、100％、120％~人淫羊 藿苷對照品，按樣品溶液的制備方法操作，分別進(jìn) 樣，計(jì)算回收率。平均加樣回收率為98．7％，RSD為 1．18％(n=6)。
2．3 淫羊藿超臨界萃取物的測定
分別按上述確定的方法制備樣品后測定淫羊藿苷的含量，3次測定結(jié)果得到淫羊藿苷在藥材中 的平均含量為0．092 mg／g。
3 結(jié)論
3．1 比較圖b和圖c可以看出，超臨界流體萃取的 選擇性較好，萃取物的淫羊藿苷含量較高，雜質(zhì)成 分相對較少，有利于粗提物的進(jìn)一步精制。索氏提 取樣品的雜質(zhì)相對較多，而且需要耗費(fèi)更多的有機(jī) 溶劑和提取時(shí)間。超臨界萃取技術(shù)可以應(yīng)用于淫羊 藿中淫羊藿苷的提取。
3．2 實(shí)驗(yàn)先后選擇甲醇一0．5％冰醋酸(60：40)、甲 醇一0．1％冰醋酸(60：40)，甲醇一0．1％冰醋酸(梯度洗 脫)體系，從分離情況和出峰時(shí)間等綜合分析，選擇 了甲醇一0．1％冰醋酸梯度洗脫，色譜條件穩(wěn)定。
3-3 超臨界CO：萃取技術(shù)在中藥提取中具有綠色 環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)針對該技術(shù)提取的淫羊藿 超臨界CO：萃取物，建立了液相色譜分析方 法，具有較高的精密度，適用于檢測淫羊藿超臨界 提取物中淫羊藿苷的含量，同時(shí)也為黃酮類成分的 超臨界萃取物質(zhì)量控制提供參考。
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