【摘要】目的 建立三棱超臨界CO2萃取物中蘆丁的鑒別和含量測定方法。方法在聚酰胺膜上點(diǎn)樣，以80%乙醇作為展開劑鑒別蘆丁，采用Symmetry C18色譜柱，以乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸（14∶1∶85）為流動相，柱溫25℃，在流速為1.0 ml?min-1，360 nm的檢測波長下，測定蘆丁含量。結(jié)果在三棱的超臨界萃取物中含有蘆丁成分，建立的液相色譜方法在蘆丁濃度為0.003 40～0.02432 mg?ml-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定，平均加樣回收率為98.56%，以峰面積作精密度實(shí)驗(yàn)，RSD為1.38%。結(jié)論三棱的超臨界萃取物中含有蘆丁，建立的液相色譜方法線性關(guān)系良好，精密度和回收率高，適合于三棱中蘆丁含量的測定。
【關(guān)鍵詞】 反相液相色譜； 薄層色譜鑒別； 蘆?。?超臨界萃取
Determination of Rutin in SFE Extract of Sparganium stoloniferum by RP?HPLC
LI Ke?yi， LIU Hong?mei*
(Biochemical Engineering College of Beijing Union University,Beijing 100023,China)
Abstract:ObjectiveTo explore whether there is rutin in SFE extract of Sparganium stoloniferum by TLC and establish a method to determine its content by RP-HPLC. Methods The determination was carried out over a Symmetry C18 column at 25℃. Methods tetrahydrofuran: 0.2% citric acid (14∶1∶85) was used as phase at a velocity of 1 ml?min-1 and the detection wavelength was set at 360nm. ResultsRutin was found in SFE extract of Sparganium Stoloniferum. The calibration curve was linear in the range of 0.003 40～0.02432 mg?ml-1 for rutin. The sample was stable within 8 hours and the recovery rate of rutin was 98.56 %. And in precision test, RSD=1.38%. ConclusionThere is rutin in SFE extract of Sparganium stoloniferum. The established RP-HPLC method has perfect linear relationship, high precision and recovery rate and it is suitable to determine the content of rutin in SFE extract of Sparganium Stoloniferum.
Key words: RP-HPLC; TLC; Rutin; Supercritical extract
三棱Sparganium stoloniferum，始載于《本草拾遺》，為常用中藥，是荊三棱科植物黑三棱的干燥塊莖，主要含揮發(fā)油類和黃酮類［1～3］，具有抗凝血及抗血栓和鎮(zhèn)痛作用［4］，臨床用于治療中風(fēng)病、冠心病、宮外孕、闌尾周圍膿腫及慢性肝炎、慢性盆腔炎等。另外其和莪術(shù)一起使用具有抑制腫瘤的功能［5］，在抗癌中藥的配方中起著非常重要的作用。目前文獻(xiàn)關(guān)于三棱的提取研究并不多，尤其是對其化學(xué)成分等基礎(chǔ)研究更少，文獻(xiàn)［6］報(bào)道的黃酮類成分為山萘酚和5,7,3',5'-四羥基雙氫黃酮醇-3-O-β-D-葡萄糖苷，還沒有三棱中含有蘆丁成分的文獻(xiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法對三棱超臨界二氧化碳萃取物中蘆丁進(jìn)行了鑒定，并利用液相色譜法對蘆丁的含量進(jìn)行測定。
1 儀器與材料
1.1 儀器與試劑
江蘇南通華安公司的Ha120-50-01型超臨界萃取裝置；島津LC-10AT vp液相色譜儀，島津Shimadzu CLASS-VP V6.12 SP4工作站；KQ - 250B 型*。
1.2 對照品與供試品
三棱（北京同仁堂集團(tuán)）；蘆丁對照品（中國生物制品檢定所）；甲醇（分析純）；乙腈（色譜純）；四氫呋喃（色譜純）；枸櫞酸（色譜純）；二氧化碳（99.95%）；本實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。
2 方法與結(jié)果
2.1 三棱超臨界提取物中蘆丁的薄層鑒別
2.1.1 供試品溶液的制備
三棱生藥粉碎、過40目篩、60℃烘干6 h ，稱1 000 g過篩的三棱粉，加入180 ml夾帶劑，充分混合，然后置于萃取釜中。對萃取釜、解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ分別進(jìn)行加熱,當(dāng)溫度分別達(dá)到設(shè)定溫度時,通過高壓泵對萃取釜和兩個解析釜進(jìn)行加壓,當(dāng)壓力分別達(dá)到設(shè)定壓力后,進(jìn)行靜態(tài)萃取，之后開始循環(huán)萃取,并保持恒溫和恒壓,CO2流量為40 L/h。萃取2h后,從解析釜I和Ⅱ的出料口放出黃色油狀液體,萃取物稱重，量體積，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻得供試品溶液。
2.1.2 蘆丁對照品溶液I的制備
精密稱取蘆丁對照品1.0 mg，置于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.02 mg?ml-1的供試品溶液。
2.1.3 薄層鑒別
用定量毛細(xì)管分別吸取上述對照品溶液I、供試品溶液各20 μl，于聚酰胺膜上分別點(diǎn)樣，以80%乙醇作為展開劑，展開，晾干，以1%的三氯化鋁乙醇溶液顯色，置紫外燈下檢視，供試品溶液在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，說明樣品中含有蘆丁成分。
2.2 三棱超臨界萃取物中蘆丁含量的測定
采用液相色譜法測定樣品中蘆丁的含量。
2.2.1 色譜條件色譜柱：Symmetry C18（250 m×4.6 nm，5 μm）；流動相：乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸（14∶1∶85），柱溫25℃；檢測波長：360 nm，流速為1.0 ml?min-1，20 μl進(jìn)樣（定量環(huán)）。在此條件下，30 min左右出峰，樣品中蘆丁和其他物質(zhì)分離良好。
2.2.2 色譜系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)按蘆丁峰計(jì)算，色譜系統(tǒng)的理論塔板數(shù)為57 059；蘆丁與其前后相鄰的色譜峰的分離度分別為2.3和1.5，蘆丁與相鄰的色譜峰可以*分離。蘆丁峰的拖尾因子為1.07，峰形對稱性良好。
2.2.3 對照品溶液II的制備精密稱取蘆丁對照品15.0 mg，置于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.3 mg?ml-1的對照品溶液Ⅱ。
2.2.4 線性關(guān)系精密吸取對照品溶液Ⅱ 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 ml置于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。按“2.2.1"色譜條件測定。以峰面積為橫坐標(biāo)、進(jìn)樣濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：
Y=-5.738 0×10-5+6.270 8×10-8X,r=0.999 9
結(jié)果：蘆丁在0.003 04 ～0.024 32 mg?ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2.5 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣品溶液室溫放置，每隔2 h進(jìn)樣一次，測定蘆丁的含量，共測5次，RSD為1.87%，說明樣品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)取同一濃度的樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定蘆丁的含量，RSD為1.38%。
2.2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密吸取5 ml已知含量的供試品溶液6份，分別置于10 ml量瓶中，分別準(zhǔn)確加入5 ml濃度為0.30 mg?ml-1的蘆丁對照品溶液，搖勻，過濾，取續(xù)濾液分別進(jìn)樣，按選定的色譜條件操作，測定其濃度，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（略）
2.2.8 樣品的測定按上述“2.1.2"方法制備供試品溶液，并根據(jù)“2.2.1"色譜條件進(jìn)行測定，用標(biāo)準(zhǔn)線性方程計(jì)算出各供試品溶液中蘆丁的含量，進(jìn)而計(jì)算出基于每克生藥材的蘆丁含量。
2.3 三棱的超臨界萃取樣品測定根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)條件安排實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法見“2.1.1"，每個實(shí)驗(yàn)條件均重復(fù)3次,取平均結(jié)果，萃取物中蘆丁的含量如表2所示。表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）
3 討論
薄層色譜表明在三棱超臨界萃取物中含有蘆丁成分。
利用紫外分光光度法在200～500 nm的波長范圍內(nèi)掃描對照品溶液，在360 nm處對照品有zui大吸收，確定360 nm為檢測波長。
在HPLC流動相的選擇中，分別選擇了甲醇和乙腈為流動相的有機(jī)相，并分別考察了乙醇-水-磷酸和乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸兩個系統(tǒng)在不同配比、不同流速條件下對樣品測定的影響，zui后確定流動相為乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸（14∶1∶85）。
采用Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸（14∶1∶85）為流動相，在流速為1.0ml?min-1，360 nm的檢測波長下，對三棱超臨界萃取物中蘆丁含量測定進(jìn)行系統(tǒng)研究。建立的方法在蘆丁濃度為0.003 40～0.024 32 mg?ml-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定，平均加樣回收率為98.56%，方法具有很高的精密度，適用于檢測三棱中蘆丁的含量。
【參考文獻(xiàn)】
［1］陳兔林，陶學(xué)勤，葉定江. 氣質(zhì)聯(lián)用法分析炮制對三棱揮發(fā)油的影響［J］. 中成藥，1999，21（1）：22.
［2］毛淑杰，沈紅. 三棱不同炮制品黃酮成分含量測定［J］. 中國中藥雜志，1999，24（1）：29.
［3］毛春芹，陸兔林，邱魯嬰. 三棱不同炮制品總黃酮鎮(zhèn)痛作用研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，17（9）：5.
［4］陳兔林，毛春芹，葉定江，等. 三棱總黃酮抗血小板聚集及抗血栓作用研究［J］. 中草藥，1999，30（6）：439.
［5］徐立春,孫震華. 三棱、莪術(shù)提取物修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗的非特異性抗瘤實(shí)驗(yàn)研究［J］. 癌癥，2001，20（20）：1880.
［6］張衛(wèi)東，王永紅，秦路平. 中藥三棱黃酮類成分的研究［J］. 中國中藥雜志，1996，21（9）：550.
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