實驗方法原理 Northern blot的基本概述是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉(zhuǎn)移至尼龍膜等固相膜載體上，用放射性或非放射性標(biāo)記DNA或RNA特異性探針對固定于固相膜上的mRNA進行雜交，洗膜去除非特異性結(jié)合雜交信號，經(jīng)放射自顯影或現(xiàn)色反應(yīng)，對雜交信號進行分析。將雜交的mRNA分子在電泳中遷移位置與標(biāo)準分子量分子進行比較，即可知道細胞中特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小；對雜交信號的強弱比較，可以知曉該基因表達mRNA水平的強弱。
實驗材料 DNA
試劑、試劑盒 MOPS電泳buffer甲醛凝膠加樣bufferEBEGFR探針DIGSSC
儀器、耗材 水平電泳儀制冰機恒溫水浴箱凝膠成像系統(tǒng)EP管移液器Tip頭
實驗步驟
一、RNA轉(zhuǎn)移與固定
1. 變性瓊脂糖電泳分離總RNA樣品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝膠片刻，10×SSC中浸泡平衡凝膠30 min。
2. 按southern blot實驗中DNA轉(zhuǎn)移方法及裝置轉(zhuǎn)移總RNA至尼龍膜上（過程中注意無RNA酶操作）。
3. 1×SSC淋洗尼龍膜后濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙中80℃烤箱烘烤2小時。
4. RNA染色，干燥的尼龍膜先于5%冰乙酸中室溫浸泡15 min。
5. 于0.5 mol/L 乙酸鈉和0.04%*溶液中浸泡5~10 min。
6. 去離子水淋洗膜5~10 min，可見RNA標(biāo)準及28s及18 sRNA的條帶，軟鉛筆標(biāo)記。
二、預(yù)雜交、雜交及顯色
1. Washing buffer潤洗1遍（3~5 min）。
2. 100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。
3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。
4. Washing buffer洗膜（15 min×2）。
5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
6. 將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數(shù)min至1天（出現(xiàn)顏色時不要搖動）。
7. 當(dāng)出現(xiàn)條帶時，TE-buffer洗膜（5 min×1），終止現(xiàn)色。
8. 照相記錄，80℃烤干，儲存。
9. 掃描計算EGFR基因擴增的倍數(shù)。
收起
注意事項
1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。
2. 凝膠中不要加入EB，以免降低雜交的效率。
3. 為降低膜雜交本底，可適當(dāng)延長預(yù)雜交時間。
實驗方法原理 在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢測。
實驗材料 總RNA樣品或mRNA樣品探針模板DNA(25 ng)尼龍膜
試劑、試劑盒 NorthernMax Kit（Cat. # 1940Ambion Inc.）瓊脂糖DEPC X光底片底片暗盒Random Primer dNTP Mixture111 TBq mmol[a-32P]dCTPExo-free Klenow Fragment和10 X Buffer Sephadex G-50SDS雙氧水 滅菌水
儀器、耗材 恒溫水浴箱電泳儀凝膠成像系統(tǒng)真空轉(zhuǎn)移儀真空泵UV 交聯(lián)儀雜交爐恒溫搖床脫色搖床漩渦振蕩器分光光度計微量移液器電爐（或微波爐）離心管燒杯量筒三角瓶
實驗步驟
一、用具的準備
1. 180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。
2. 電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡，用DEPC水沖洗，干燥備用。
3. 處理DEPC水(2 L)備用。
二、用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。
三、制膠
1. 稱取0.36 mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4 ml DEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖*熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補充蒸發(fā)的水分)。
2. 在通風(fēng)廚中加入3.6 ml的10*Denaturing Gel buffer，輕輕振蕩混勻。
注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。
3. 將熔膠倒入制膠板中，插上梳子
如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或?qū)馀萃频侥z的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5 cm。
4. 膠在室溫下*凝固后，將膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1 cm，小心拔出梳子。（配制250 ml 1*MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補充蒸發(fā)的buffer。）
5. 檢查點樣孔。
四、RNA樣品的制備
在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當(dāng)?shù)腅B（終濃度為10 ug/ml）?；靹蚝?，65℃空氣浴15 min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5 min。
五、電泳
1. 將RNA樣品小心加到點樣孔中。
2. 在5 V/cm下跑膠（5ｘ14 cm）。在電泳過程中，每隔30 min短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液后繼續(xù)電泳。當(dāng)膠中的溴紛藍（500 bp）接近膠的邊緣時終止電泳。
3. 紫外燈下，檢驗電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點樣孔的距離。
注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。
六、轉(zhuǎn)膜
1. 用3%雙氧水浸泡真空轉(zhuǎn)移儀后，用DEPC水沖洗。
2. 用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。
3. 連接真空泵和真空轉(zhuǎn)移儀，剪取一塊適當(dāng)大小的膜（膜的四邊緣應(yīng)大于塑膠屏孔口的5 mm），膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當(dāng)位置。
4. 蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。
5. 將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，并至少蓋過邊緣約2 mm，以防止漏氣。
6. 將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。
7. 打開真空泵，使壓強維持在50~58 mbar；立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10 min在膠面加上1 ml transfer buffer，真空轉(zhuǎn)移2小時。
8. 轉(zhuǎn)膜后，用鑷子夾住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒，去除殘余的膠和鹽。
9. 用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于UV交聯(lián)儀中自動交聯(lián)。
10. 將膠和紫外交聯(lián)后的膜，在紫外燈下檢測轉(zhuǎn)移效率。(避免太長的紫外曝光時間)。
11. 將膜在-20℃保存。
七、探針的制備
1. 在1.5 ml離心管中配制以下反應(yīng)液：
模板DNA(25 ng) ：1ul
Random Primer ：2ul
滅菌水： 11ul
總體積：14ul
2. 95°C加熱3分鐘后，迅速放置于冰冷卻5 min。
3. 在離心管中按下列順序加入以下溶液：
10×Buffer ：2.5 ul
dNTP Mixture ：2.5 ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP ：5 ul
Exo-free Klenow Fragment ：1 ul
4. 混勻后（25 ul），37°C下反應(yīng)30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。
5. 65°C加熱5 min使酶失活。
八、探針的純化及比活性測定
1. 準備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中，浸泡。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數(shù)次，以除去可溶解的葡聚糖。換用新配制的TE（PH7.6）。
2. 取1ml一次性注射器，去除內(nèi)芯推捍，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。
3. 將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘，凝膠壓緊后，補加Sephadex G-50凝膠懸液，重復(fù)此步直至凝膠柱高度達注射器0.9ml刻度處。
4. 100ul STE緩沖液洗柱，1600g離心4min。重復(fù)3次。
5. 倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中，再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準1.5ml離心管。
6. 將標(biāo)記的DNA樣品加入25 ul STE，取出0.5ul點樣于DE8 paper上，其余上樣于層析柱上。
7. 1600g離心4min，DNA將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點樣于DE8-paper.
8. 測比活性(試劑比活要求:10 6cpm/ml）。
九、預(yù)雜交
1. 將預(yù)雜交液在雜交爐中68℃預(yù)熱，并漩渦使未溶解的物質(zhì)溶解。
2. 加入適當(dāng)?shù)腢LRAhyb到雜交管中(以100cm2 膜面積加入10 mlULRAhyb雜交液)，42℃預(yù)雜交4 h。
十、探針變性
1. 用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。
2. 90℃熱處理稀釋后探針10 min后，立即放置于冰上5 min。
3. 短暫離心，將溶液收集到管底。
十一、雜交
1. 加入0.5 ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后，將探針加到預(yù)雜交液中。
2. 42℃雜交（14~24 h）。
雜交完后，將雜交液收集起來于－20℃保存。
十二、洗膜
1. 低嚴緊性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100 cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，室溫下，搖動洗膜5 min兩次。
2. 高嚴緊性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100 cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，42℃ 搖動洗膜20 min兩次。
十三、曝光
1. 將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。
2. 檢查膜上放射性強度，估計曝光時間。
3. 將X光底片覆蓋與膜上，曝光。
4. 沖洗X光底片，掃描記錄結(jié)果。
十四、去除膜上的探針
將200 ml 0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，將膜放入，室溫下讓SDS冷卻到室溫，取出膜，去除多余的液體，干燥后，可以保存幾個月。
十五、雜交結(jié)果
操作應(yīng)該小心，但不必緊張。用于RNA電泳、轉(zhuǎn)膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶，以免樣品的降解。轉(zhuǎn)膜時，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡。
