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植物總DNA的快速少量抽提實(shí)驗(yàn)

閱讀：334發(fā)布時(shí)間：2015-5-15

植物總DNA的快速少量抽提實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理    CTAB法：該方法簡(jiǎn)便、快速，DNA產(chǎn)量高(純度稍次，適用于一般分子生物學(xué)操作)。 CTAB是一種非離子去污劑，植物材料在CTAB的處理下，結(jié)合65 °C水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放出來(lái)。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（>0.7 mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5 mM NaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再用70－75%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。再經(jīng)過(guò)氯仿/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來(lái)純化DNA，zui后經(jīng)異丙醇或乙醇等DNA沉淀劑將DNA沉淀分離出來(lái)。
實(shí)驗(yàn)材料    水稻葉片
試劑、試劑盒    液氮CTAB氯仿異戊醇乙醇NH4ACEtOH
儀器、耗材    離心管離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  采集適量幼嫩葉片，用液N2研成粉末，0.4 g裝入1.5 ml離心管中（-20 ℃預(yù)冷）。

2.  預(yù)熱1.5×CTAB到95 ℃，加1 ml到裝有葉片粉末的離心管中，混勻（防止凍融）。

3.  立即置于65 ℃水浴30min，每5分鐘，上下顛倒1次。

4.  12000 g離心5分鐘。

5.  吸取上清液約600 μl，加入等體積（600 μl）氯仿/異戊醇(24:1)，上下顛倒數(shù)次，至下層液相呈深綠色為止。

6.  12000 g離心5分鐘。

7.  取450 μl上清于一新1.5 ml離心管，加入1 ml 95%乙醇和45 μl 10 M NH4AC），混勻，室溫放置10min。

8.  12000 g離心10min，去上清，用75% EtOH浸洗沉淀，自然干燥約30 min。

9.  加入50 μl 1/10 TE或無(wú)菌水（含20 mM/RNase），置于4 ℃，待DNA溶解后，檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。
收起 
注意事項(xiàng)    
1.  盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類(lèi)物質(zhì)多，必須用10 mM的β-ME處理。

2.  研缽預(yù)凍，粉末至加CTAB前不要融化。

3.  24:1的氯仿/異戊醇抽提時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，轉(zhuǎn)移用的槍頭是剪寬了的。

4.  所用試劑必需滅菌，手套。


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