過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50 管/48 樣
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：
POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)和胺類(lèi)化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的雙重作用。
測(cè)定原理：
POD 催化 H2O2 氧化特定底物，在 470nm 有特征光吸收。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成：
提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體×2 瓶，4℃保存；用時(shí)每瓶加入 5mL 試劑一充分溶解；用不完的試劑 4℃保存；試劑三：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟和加樣表：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 470nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 測(cè)定前將試劑一、二和三在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上。
3、 樣本測(cè)定表
試劑名稱(chēng)（µL） | 測(cè)定管 |
樣本 | 15 |
蒸餾水 | 270 |
試劑一 | 520 |
試劑二 | 130 |
試劑三 | 135 |
| |
- 1mL 玻璃比色皿中按順序加入上述試劑，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄 470nm 下 30s 時(shí)的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。計(jì)算 ΔA＝A2-A1。
注意：
1、若一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液，在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上，測(cè)定時(shí)加入 15µL 樣本和 1055µL 混合液測(cè)定。
2、如果 ΔA 小于 0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到 5min。如果 ΔA 大于 0.5，可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
POD 活性計(jì)算：
1、血清（漿）POD 活性
單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。
計(jì)算公式：
POD（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =7133×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 POD 活性
- 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。
POD（U/104 cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =14.27×ΔA
- 反總：反應(yīng)體系總體積，1.07mL； V 樣：加入樣本體積，0.015mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。
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