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染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與總蛋白含量

閱讀:300發(fā)布時間:2016-7-20

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與總蛋白含量

 

一、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

    Darzynkiewicz和他的同事們用流式細胞術作了大量染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的工作。他們首先用RNA酶處理細胞,除去RNA,然后用酸變性或者熱變性等方法使DNA部分變性。變性的部分由雙鏈變成單鏈。AO標記后,凡是已變性的單鏈核酸由發(fā)綠色熒光變成發(fā)紅色熒光,所以紅色熒光的強度說明染色質(zhì)變性的程度。由于細胞周期各時相中,染色質(zhì)的凝集程度不同,經(jīng)酸或熱處理后,變性程度也不同,染色質(zhì)越凝集,對酸和熱變性越敏感。他們用這種方法區(qū)分出了細胞周期各時相如G0、G1、S、G2和M期細胞。

   AO酸變性的程序為:首先配制AO貯液、A液和B液。AO貯液濃度為1mg/ml,在蒸餾水中;A液由0.1MHCI和0.1MKCI組成,pH1.4;B液由8ug/ml  AO、0.2M、Na2HPO4和0.1M檸檬酸組成,pH2.6。

   以70%冷乙醇在4℃固定細胞至少12小時,離心洗細胞后,將細胞沉淀重新懸浮在PBS緩沖液中(pH7.4),細胞濃度為106細胞/ml。在室溫下,取0.2ml細胞,加入0.5ml  A液,30秒后立即加入2ml  B液,染色2至10分鐘,立即進行流式分析。

二、總蛋白含量

   測定總蛋白含量能夠檢測一個細胞群體生長和代謝的狀態(tài),也可以區(qū)別具有不同蛋白含量的細胞亞群,如血液中的白血細胞。

   FITC(Fluorescein  isothiocyanate,異硫氰基熒光素)是檢測總蛋白zui常用的熒光探針。它是酸性染料,以共價鍵方式結(jié)合到蛋白的帶有正電荷的基上,以藍光激發(fā)后,發(fā)出明亮的綠色熒光。

   FITC的貯液以濃度1mg/ml制備在純乙醇中,使用時用PBS(pH7.4)稀釋成所需工作液。FITC和PI對固定細胞的總蛋白和DNA雙染的方法是:將固定的細胞懸浮在含有18ug/ml  pI,0.05ug/mI  FITC和40ug/ml  RNase的PBS液中,室溫下至少染20分鐘后,進行流式分析。

    FITC不能穿過活細胞的膜,若丹明640(Rhodamine 640)能對活細胞的蛋白進行染色,使用濃度為1—5ug/ml,若丹明640zui大激發(fā)峰為582nm,zui大發(fā)射峰為601nm。


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