在ELISA試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶聯(lián)絡(luò)物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留心不可濺起，不可發(fā)作氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)矩的量參與板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，防止發(fā)作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。在ELISA試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留心不可濺起，不可發(fā)作氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)矩的量參與板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，防止發(fā)作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。
在ELISA試劑盒檢查中，質(zhì)量確保是一個(gè)雜亂的進(jìn)程，很多主要的環(huán)節(jié)都影響到檢查的質(zhì)量。現(xiàn)分述如下：
《一》辦法學(xué)的影響
ELISA測(cè)定模式包含以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競(jìng)賽抑制法，其間競(jìng)賽抑制法因受操作時(shí)差所導(dǎo)致的競(jìng)賽等要素的影響，成果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難操控。
《二》試劑要素
1.試劑的挑選
免疫檢查的原理均根據(jù)抗原抗體反響。由于該反響進(jìn)程受多種要素的影響，如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、穿插反響等，因而檢查成果難以溯源，不一樣辦法、不一樣試劑之間乃至同一試劑不一樣批號(hào)間成果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決議了檢查的水平，因而在引進(jìn)新項(xiàng)目之前有必要對(duì)試劑進(jìn)行嚴(yán)厲的評(píng)估。試劑的評(píng)估有以下幾個(gè)進(jìn)程：⑴斷定展開(kāi)該項(xiàng)意圖必要性;⑵了解該項(xiàng)目現(xiàn)有的檢查辦法和原理;⑶在了解試劑的組成基礎(chǔ)上挑選多家試劑盒進(jìn)行比較，判別規(guī)范參閱辦法或參閱物質(zhì)，其次為臨床的滿意度及機(jī)構(gòu)的陳述如各級(jí)室間質(zhì)量評(píng)估、CDC陳述等;⑷定期對(duì)檢查成果進(jìn)行追尋反響直至終究認(rèn)可該試劑。
2.試劑的預(yù)備
不一樣批次的ELISA試劑在制作進(jìn)程中很難確保質(zhì)量*一致，即使是經(jīng)過(guò)批批檢的項(xiàng)目其檢查成果也存在區(qū)別，因而有必要挑選和訂貨長(zhǎng)批號(hào)的試劑，并確保保留條件。嚴(yán)厲執(zhí)行這一規(guī)范能夠防止因試劑批號(hào)改動(dòng)而從頭樹(shù)立質(zhì)控體系及從頭評(píng)估試劑的雜亂進(jìn)程，而且能夠確保成果的穩(wěn)定性;對(duì)于效期短、運(yùn)用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，每次運(yùn)用則取分裝有些即可，防止重復(fù)凍融形成試劑的失效。
試劑運(yùn)用前有必要平衡至室溫，否則會(huì)影響檢查下限。未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需運(yùn)用的試劑應(yīng)密封并及時(shí)放回冰箱保留。
《三》ELISA試劑盒樣本要素
標(biāo)本攪擾要素包含內(nèi)源性攪擾要素和外源性攪擾要素，前者包含類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、本身抗體、*等，后者包含標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本儲(chǔ)存時(shí)刻過(guò)長(zhǎng)、標(biāo)本凝結(jié)不全、冷凍標(biāo)本的重復(fù)凍融等。其間外源性攪擾要素是咱們?cè)跈z查進(jìn)程中能夠防止也是有必要防止的要素，而防止內(nèi)源性要素的攪擾則主要經(jīng)過(guò)挑選適宜的試劑盒。在臨床中遇到罕見(jiàn)的疑問(wèn)病例時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性攪擾要素的存在。以下對(duì)外源性攪擾要素進(jìn)行扼要說(shuō)明：
1.標(biāo)本溶血 要注意防止呈現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中富含血紅素基團(tuán)，其具有類過(guò)氧化物的活性，因而，在以辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為符號(hào)酶的ELISA測(cè)定中，假如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很簡(jiǎn)單在溫育進(jìn)程中吸附于固相，然后與后邊參加的底物反響顯色。
2.標(biāo)本被細(xì)菌污染 標(biāo)本的收集及血清別離要注意盡量防止細(xì)菌污染。細(xì)菌菌體中除也許富含內(nèi)源酶對(duì)測(cè)定發(fā)生非特異性攪擾外，還也許對(duì)抗原抗體等蛋白發(fā)生分化效果。別的標(biāo)本在保留中呈現(xiàn)污濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢查。
3.標(biāo)本儲(chǔ)存時(shí)刻過(guò)長(zhǎng) 標(biāo)本在低溫下保留時(shí)刻過(guò)長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)致使本底加深、乃至呈現(xiàn)假陽(yáng)性成果。一般情況下血清標(biāo)本可在2～8℃下保留l周，冷凍保留時(shí)刻會(huì)更長(zhǎng)，但對(duì)于抗體或抗原含量低的標(biāo)本而言，則也許會(huì)因抗體掉價(jià)、抗原分化而呈現(xiàn)假陰性成果。
4.ELISA試劑盒標(biāo)本凝結(jié)不全 血液一般在收集后半小時(shí)后開(kāi)端凝結(jié)，18～24h*凝結(jié)。假如在血液未凝結(jié)時(shí)即離心別離血清，則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而形成假陽(yáng)性成果。為了縮短標(biāo)本處理時(shí)刻，能夠在離心前將血液標(biāo)本置于溫箱中溫育或許選用帶別離膠的*或于*中參加恰當(dāng)?shù)拇倌齽┮约涌煅宓膭e離。
5.冷凍保留標(biāo)本防止重復(fù)凍融 標(biāo)本的重復(fù)凍暢通領(lǐng)悟因其所發(fā)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子發(fā)生損壞效果，使抗體效價(jià)下跌然后導(dǎo)致假陰性成果，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保留作屢次檢查，宜少量分裝凍存。此外，標(biāo)本在凍存時(shí)會(huì)因蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，因而從頭融解的標(biāo)本有必要混勻，但不要進(jìn)行劇烈振動(dòng)，重復(fù)倒置即可。
按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的央求預(yù)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA試劑盒頂用的蒸餾水或去離子水，包含用于洗刷的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液運(yùn)用pH計(jì)丈量較正。從冰箱中取出的實(shí)驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后運(yùn)用。試劑盒中本次實(shí)驗(yàn)不需用的有些應(yīng)及時(shí)放回冰箱保留。
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