線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ_氧化磷酸化系列
測(cè)定方法：分光光度法
產(chǎn)品規(guī)格：25管/24樣
注 意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
線粒體復(fù)合體Ⅱ又稱(chēng)琥珀酸-輔酶Q還原酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時(shí)輔基FAD還原為FADH2，后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q，是呼吸電子傳遞鏈的支路。
線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ_氧化磷酸化系列
測(cè)定原理：
復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通過(guò)檢測(cè)2,6-二氯吲哚酚的減少速率來(lái)計(jì)算該酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：5mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1支，-20℃保存；
試劑四：液體25mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑七：液體2.5mL×1瓶，4℃保存；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g，4℃離心5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅱ（此步可選做）。
5、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅱ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至605nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）工作液的配制：臨用前把試劑五和試劑六轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃
（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
（2）在1mL玻璃比色皿中加入40μL樣本、100μL試劑七和800μL工作液，立即混勻，記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1和 2min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
復(fù)合體Ⅱ活力單位的計(jì)算：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=113×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =0.226×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，9.4×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。
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