小鼠干細胞因子純化活性測定又稱為肥大細胞生長因子、c-kit配 體。天然SCF是分子量約為18. 5KD的酸性糖蛋白,它是由骨髓基質細胞產生。 其與c-kit的結合,可調節(jié)造血干細胞、肥大細胞、黑色素細胞和生殖細胞和增 殖,生長、分化和移行等生理功能。該因子可用于治療貧血,并在骨髓移植、基 因治療、體外造血干細胞培養(yǎng),干細胞移植和抗輻射損傷等工作中有廣泛應用。 在種屬特異性方面,人和小鼠的SCF的同源性達83%。雖然人SCF對小鼠造 血干細胞的增殖影響不大,但小鼠SCF（mSCF）對人造血干細胞的作用卻與人SCF 相似。天然的SCF主要由山骨髓基質細胞產生,來源少,難以大規(guī)模純化。但是由 于SCF的生物學活性不依賴于糖基化,因此原核表達系統(tǒng)是一種提供大量SCF的 有效手段 本研究取發(fā)育至十天左右的小鼠胚胎,研碎后提取總RNA,采用 RT-PCR方 法從小鼠胚胎總RNA中獲得小鼠SCF的cDNA,并克隆入pGEM-T內成pGEM-T-SCF。 用BamHI和Xhol將mSCF cDNA從pGEM-T-SCF內切出并克隆入pGEX-4T-3內 谷胱甘肽轉移酶（GST）基因的下游成表達質粒pGEX-4T-3-SCF,將 pGEX-4T-3-SCF轉化大腸桿菌BL21后,在0. 5mMTPTG和35℃條件下誘導表達。 誘導菌體的裂解物經12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGF）后,確定為預 期的53KD的融合表達條帶,用山羊抗GST抗體進行Western-blot試驗,結果確 證了融合蛋白的表達。 誘導H.菌液,細菌經超聲破碎后離心取上清,通過 Glutathione Sepharose-4B親和吸附融合形式的重組小鼠干細胞因子（rmSCF）,用凝血酶在 柱上直接酶切,zui后用5倍柱體積的PBS將rmSCF洗下,結果獲得純度約為80% 的rmSCF,rmSCF為27KD。由于獲得的rmSCF中含有一定量的GST和其它雜蛋白 （部分是融合形式的GST-rmSCF）,將rmSCF重新進行（Glutathione Sepharose-4B 親和層析以去除其中的GST和GST-rmSCF蛋白,經5次親合后rmSCF的純度可 達85%。為了進一步提高純度,用Q-Sepharose柱對親合純化獲得的rmSCF進行 了離子交換層析,平衡液為10mmol/LTris-HCL,pH7. 2,梯度洗脫液為 10mmol/LTris-HCL,pH7. 2和1 mol/LNaCL。經梯度洗脫,當鹽濃度在0. 36mol/L 時可將rmSCF洗脫下來,緊接著分別用截留分子量為10000D和30000D的超膜膜 對離子交換層析后獲得的rmSCF進行超濾,這樣下來,rmSCF的純度可達90%以 上。 用rmSCF協(xié)同rhGM-CSF刺激人骨髓細胞集落形成的方法檢測rmSCF的活性, 結果表明,當分別用50 ng/ml,100 ng/ml及200 ng/ml的rmSCF的協(xié)同作用的。