1， 什么時候需要穩(wěn)定細(xì)胞株？

以下實驗，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株而不是瞬時轉(zhuǎn)染geng能滿足實驗要求：

1)，外源片段在分裂細(xì)胞中經(jīng)久(>2周)穩(wěn)定表達(dá)。雖然普通轉(zhuǎn)染實驗一般只能保證2-4天的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率，但腺病毒載體在多數(shù)分裂細(xì)胞中可以維持2-4周內(nèi)的高轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)周期。而非分裂細(xì)胞，可以使用腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因，因為腺相關(guān)病毒載體在許多非分裂細(xì)胞中可以保持長達(dá)1年的高效表達(dá)。

2)，需要構(gòu)建使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，這主要是由于：a)，過表達(dá)基因或者干擾目的基因引起細(xì)胞毒性或者抑制細(xì)胞生長等不利因素; b)，目的基因的過表達(dá)或者干擾需要時空特異性。

3)，希望控制目的基因過表達(dá)或者干擾的拷貝數(shù)，以避免引入人為因素影響實驗結(jié)果的精-確性。構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實驗研究。

4)，部分細(xì)胞種類，病毒載體亦無法達(dá)到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，達(dá)到外源片段的高效表達(dá)。

5)，經(jīng)久在少數(shù)幾類細(xì)胞中研究幾個基因的功能，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也極-大方便實驗研究。

6)，部分蛋白穩(wěn)定性*，瞬時RNA干擾因為作用周期短，只能抑制目的基因的表達(dá)，但無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，所以需要通過構(gòu)建穩(wěn)定株實現(xiàn)geng好的基因干擾效果。

7)，需要往動物體內(nèi)注射表達(dá)有外源片段的細(xì)胞。需要構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株，以防止注射入動物體內(nèi)后，很快外源片段表達(dá)丟失。

8)，細(xì)胞個體差異(同一類細(xì)胞，不同個體細(xì)胞基因組存在差異)對實驗結(jié)果有干擾，需要構(gòu)建單克隆細(xì)胞株去除干擾。

9)，需要將外源片段插入基因組中，比如基因敲除，基因插入突變篩選等修飾基因組的實驗。

2， 什么時候不需要構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株？

以下實驗不需要構(gòu)建穩(wěn)定株：

1)，希望迅速觀察目的基因過表達(dá)或者干擾效果。例如在正式實驗之前進(jìn)行的小規(guī)模預(yù)實驗。

2)，2-4天的瞬時表達(dá)已經(jīng)可以達(dá)到具體的實驗?zāi)康模热鐧z測兩個外源轉(zhuǎn)染的目的蛋白之間的相互作用，或者觀察某些細(xì)胞周期抑制，凋亡或細(xì)胞存活相關(guān)基因的細(xì)胞表型。

3)，細(xì)胞個體差異對實驗結(jié)果有影響。體外培養(yǎng)非原代細(xì)胞，多為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或者癌細(xì)胞，細(xì)胞個體差異大，瞬時轉(zhuǎn)染或者使用腺病毒/腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)geng可以反映細(xì)胞群體行為?；蛘呤褂媚孓D(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建混合穩(wěn)定株。