二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）試劑盒說明書

分光光度法 25 管/24 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶，既控制著CO2的固定，同時(shí)又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影響著光合速率。

二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）試劑盒說明書測定原理：

在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）與 1 分子的 CO2 結(jié)合，產(chǎn)生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），PGA 可通過外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶 I（NADH）氧化。因此，340nm 吸光度的變化可計(jì)算還原型輔酶 I 氧化速率，還原型輔酶 I 氧化速率可反應(yīng) Rubisco 的活性。
需自備的儀器和用品：

可見-紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：

提取液一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
提取液二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：25mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 875uL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 875uL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）試劑盒說明書粗酶液制備：

①總 Rubisco 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定。②胞漿和葉綠體 Rubisco 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃，8000g 離心 10min，取上清用于測定胞漿 Rubisco 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定葉綠體中 Rubisco 酶活性。

建議測定總 Rubisco 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的Rubisco，則按照步驟②提取粗酶液。

測定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前在試劑二中加入 22.5mL 試劑一，充分混勻，在 25℃孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；3、測定：在 1mL 石英比色皿中依次加入 30uL 樣本、35uL 試劑三、35uL 試劑四和 900uL
工作液，混勻；記錄340nm 處20 s 時(shí)吸光值A(chǔ)1 和2 min 20 s 時(shí)的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
Rubisco 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 n mol NADH。

Rubisco 活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T =2680×ΔA÷Cpr

此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。2、按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：25℃中 1 g 組織 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco 活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V  反總÷ （ε×d ）×109]÷(V  樣÷V  樣總×W)

÷T=2680×ΔA÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義：

二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）試劑盒說明書V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g。