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初級(jí)會(huì)員 | 第10年

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技術(shù)大咖秀|“單抗藥物純化工藝探索與開發(fā)”Q&A精彩回顧

時(shí)間:2015/10/20閱讀:6709
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十一長(zhǎng)假結(jié)束,小編正式回歸。zui近新聞也是目不暇接,前有國(guó)人屠呦呦獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),后有AB教主的世紀(jì)婚禮。為了讓還在倒時(shí)差的各位親們能更好 的跟上時(shí)代的新步伐,小編特意整理了哥家9月 24日下午19:15 ~21:00由資深技術(shù)專家?guī)淼摹皢慰寺】贵w藥物純化工藝探索與開發(fā)"精彩Q&A回顧。錯(cuò)過的親們,讓我們一起再次感受知識(shí)的力量吧!

1干貨回答 讓您分分鐘了解抗體純化工藝

什么是反壓、壓力降?

答疑解惑

了解基本名詞術(shù)語"

反壓是層析過程中,泵產(chǎn)生流速,流速作用層析柱產(chǎn)生的壓力。如下圖所示:

層析柱的反壓以及壓力降
圖為?KTA Avant 的壓力顯示

0.5MPa 為層析柱的反壓,壓力降為0.3MPa

層析柱產(chǎn)生反壓:主要是層析介質(zhì),層析柱的設(shè)計(jì),層析柱篩板等。真正影響層析介質(zhì)的為壓力降,壓力降高于層析介質(zhì)的耐壓,層析介質(zhì)會(huì)損壞。

層析填料入廠檢驗(yàn)做哪些比較合適?

答疑解惑

填料檢驗(yàn)多重標(biāo)準(zhǔn)"

原料入廠GMP要求做檢測(cè),合格才能進(jìn)廠使用。一般有幾種方法:

審計(jì)供應(yīng)商

做供應(yīng)商審計(jì)是否復(fù)合ISO等要求,確認(rèn)此供應(yīng)商符合我項(xiàng)目要求,所以可以免檢。

自己檢測(cè)

此需要在工藝開發(fā)中做層析介質(zhì)重要參數(shù)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的確定。(例如:層析介質(zhì)的顆粒在XX-XXum時(shí),產(chǎn)品的質(zhì)量才能到達(dá)要求,并且供應(yīng)商的產(chǎn)品不同批次 的顆粒有較大差別,所以確定顆粒為比檢項(xiàng)目)。對(duì)于這個(gè)問題,國(guó)外藥廠一般在工藝開發(fā)時(shí),至少做3批不同批號(hào)的層析介質(zhì)實(shí)驗(yàn)以確定供應(yīng)商出廠指標(biāo)范圍內(nèi)可 以滿足要求。

Protein A和Protein G兩種介質(zhì)在純化抗體有何區(qū)別,結(jié)合位點(diǎn)各有幾個(gè)?

答疑解惑

Protin A和G的區(qū)別結(jié)合位點(diǎn)"?

Protein G 的結(jié)合位點(diǎn)
Protein G與Ig G的Fc結(jié)合,同時(shí)也可以結(jié)合IgG CH1區(qū)域。此配基為 17KD, PI 4.1. 在全抗體或Fc融合蛋白的純化中由于Protein A 層析介質(zhì)的載量高于Protein G,所以一般使用Protein A層析介質(zhì)。
Protein A 的結(jié)合位點(diǎn)
與IgG結(jié)合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4。
Protein A與抗體IgG 結(jié)合區(qū)域

Protein A與抗體IgG 結(jié)合有兩個(gè)區(qū)域,Fc 與Fab。主要與Fc的CH2,CH3 結(jié)合的是Protein A 的B,與Fab 結(jié)合位點(diǎn)是VH3

各環(huán)節(jié)中濃縮和換液采用膜包還是中空纖維,二者有什么區(qū)別?

答疑解惑

用途區(qū)別"

中空纖維

中空纖維一般用于樣品中含有沉淀、渾濁、顆粒等,以及低剪切力的樣品
膜包
膜包用于樣品比較干凈的樣品

在工藝中區(qū)別"

中空纖維

用于低剪切力的病毒濃縮;固液分離;澄清;以及包涵體復(fù)性等
膜包
用于緩沖液更換,濃縮等

2、速問速答小問題大門道,好知識(shí)速速來襲

層析除病毒驗(yàn)證,

需要做舊膠的驗(yàn)證嗎?

答疑解惑

關(guān)于病毒驗(yàn)證是否需要做舊膠還沒有聽到法規(guī)的要求。新藥報(bào)批時(shí)一般要求工藝驗(yàn)證,在工藝驗(yàn)證中會(huì)涉及層析介質(zhì)的壽命。層析介質(zhì)壽命的確定是有效去除雜質(zhì)達(dá)到質(zhì)量要求。親和層析/離子交換介質(zhì)已經(jīng)有文章證明Protein A在壽命內(nèi)有*病毒去除。

非糖基化的抗體

采用什么技術(shù)來去除?

答疑解惑

非糖基化的抗體一般是抗體片段(CHO表達(dá)的為有糖基),抗體片段一般使用Protein L吸附Fab

陰離子交換低電導(dǎo)較好,但zui近做了DOE,

發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)11比較好,何解?

答疑解惑

陰離子交換一般采用流穿模式(FT),所以需要一定的電導(dǎo)率讓抗體(單體)流穿,其他雜質(zhì)吸附。不同的樣品還是以實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)


能否介紹一些FC-肽融合蛋白的精細(xì)純化方法?

答疑解惑

FC-融合蛋白的的精細(xì)純化一般采用陰/陽離子交換。也有使用HIC,或羥基磷灰石的純化。還要根據(jù)樣品做DOE。

柱高不變,直徑由1.6cm放大到比如20cm,柱壓會(huì)增大多少?

答疑解惑

層析放大的原理為直徑放大,柱高不變(即線性流速或保留時(shí)間不變)。在放大時(shí)層析柱的分配器,以及篩板設(shè)計(jì)非常重要。設(shè)計(jì)優(yōu)異的柱壓一般不會(huì)增大。


工藝驗(yàn)證中需要確定CQA,CPP,可以針對(duì)一個(gè)層析方法說明一下確認(rèn)的方法嗎?

答疑解惑


首 先確定不同步驟主要去除雜質(zhì)以及去除雜質(zhì)能力,例如陽離子去除聚體步驟,經(jīng)過此步驟聚體可以從2%降至0.3%。經(jīng)過DOE實(shí)驗(yàn)確定,CPP: 為上樣量(xx-xxmg/ml),樣品電導(dǎo)率(~~),洗脫時(shí)的電導(dǎo)率范圍。在以上的條件下可以滿足CQA(0.3%以下)聚體的要求。

陰離子流穿模式,說的載量指的是目的蛋白載量?VH一個(gè)domain的純化可以用Protein A親和嗎?

答疑解惑

陰離子流穿模式(FT)的載量指的是抗體的量。一般在上樣是抗體流穿,檢測(cè)純度,HCP等,至超標(biāo)時(shí)上樣的抗體的量為載量

Protein A (重組的,非修飾的)與VH3結(jié)合

3、案例分享 ?用實(shí)驗(yàn)中的真實(shí)案例答疑解惑

有沒有關(guān)于酸堿異構(gòu)體組分降低的案例分享?

答疑解惑

對(duì)于酸堿異構(gòu)體的分離一般比較困難,因?yàn)椴町愝^小。在GE的應(yīng)用文獻(xiàn)中有使用Capto S ImpAct分離的。一般使用陽離子交換(顆粒小的30-40um),做線性梯度洗脫。也可以在DOE時(shí)設(shè)計(jì)鹽梯度與改變pH同時(shí)的洗脫策略。

現(xiàn)在我做的抗體,proteinA 捕獲時(shí)只要載量高就會(huì)出現(xiàn)渾濁,低載量澄清?

答疑解惑

Protein A的層析介質(zhì)
一般Protein A的層析介質(zhì)載量在30-50g/l,洗脫時(shí)可以達(dá)到10-20mg/ml濃度,工程抗體的溶解度較高,一般較少出現(xiàn)沉淀。但是有時(shí)洗脫時(shí)由于HCP沒有去除干凈,洗脫液中會(huì)有沉淀,過夜或低pH后更明顯
建議
檢測(cè)抗體的溶解度,檢測(cè)洗脫的HCP的量

此步驟可以使用低pH(pH在5-6,要實(shí)驗(yàn)),加入一些鹽或低濃度尿素等

宿主DNA和宿主蛋白是否是同步去除的,宿主DNA如何更好去除?

答疑解惑

DNA/HCP一般會(huì)同步去除,只是不同步驟去除的量稍有不同。 對(duì)于DNA的去除,親和/陽離子交換/HIC不吸附,陰離子交換吸附。只有實(shí)驗(yàn)才能確定您的項(xiàng)目哪種。

抗體的等電點(diǎn)能否用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè),消光系數(shù)怎么計(jì)算?

答疑解惑

一般預(yù)測(cè)的軟件得到的一些參數(shù)不是很準(zhǔn)確,不同的表達(dá)系統(tǒng),不同的培養(yǎng)方法,所得到的等電點(diǎn)不同。所以只能參考。

消光系數(shù)的公式
A=ECL,E消光系數(shù),C濃度,L光徑。使用純的抗體樣品標(biāo)定消光系數(shù)。
小技巧

使用1mlHitrap MabSelect Sure純化收集洗脫樣品,使用Lowry或Bradford標(biāo)定消光系數(shù)。在之后的工藝探索中可以簡(jiǎn)單的使用紫外吸收值定量。

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