側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)介紹

1、側(cè)向?qū)游觯步袀?cè)向流層析、側(cè)流層析，在POCT技術(shù)中，應(yīng)用最為廣泛。側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)是20世紀(jì)90年代在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)，具有快速、簡便、單人份檢測、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測、食品質(zhì)量監(jiān)測、環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)、出入境檢驗(yàn)檢疫、法醫(yī)定案等領(lǐng)域。

側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)以大孔徑的微孔濾膜（NC膜、硝酸纖維素膜）為載體，將特異性的抗原或抗體固定在NC膜上，當(dāng)待測樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細(xì)作用側(cè)向移動(dòng)，與結(jié)合墊上的膠體金或微球標(biāo)記的試劑發(fā)生特異的免疫反應(yīng)，再移動(dòng)到NC膜上，被固定在NC膜表面的抗原或抗體捕獲，聚集在檢測帶上，通過目測硝酸纖維素表面標(biāo)記物（膠體金或乳膠顆粒）的光反射信號(hào)的密度得到直觀的顯色結(jié)果。其它未結(jié)合的標(biāo)記物則越過檢測帶，流入吸水墊中，達(dá)到自動(dòng)分離的目的。

2、分類

按照檢測物的類別劃分，可以分為兩大類，分為免疫層析和核酸層析，在免疫層析中又可分為抗體檢測和其他檢測（抗原、激素等）2個(gè)子類。

也有按照出結(jié)果的方式不同，分為定性和定量、半定量。

還有根據(jù)顯色物或信號(hào)物質(zhì)、標(biāo)記物質(zhì)不同分為：有色側(cè)流層析、熒光側(cè)流層析、磁信號(hào)側(cè)流層析等。

很多人將POCT看成側(cè)流層析，這是很大的誤解，側(cè)流層析是POCT技術(shù)中很小的一部分，以后會(huì)慢慢介紹的，是樹木和森林的關(guān)系。

根據(jù)標(biāo)記物的種類不同分類

3、任何事物都有兩面性，側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)也不例外

優(yōu)點(diǎn)：一步檢測，沒有多余的清洗過程

          多通道、單通道可靈活選配，占用空間小

          快速、低成本、少的樣本量

          無需機(jī)器也可判讀定性和半定量的結(jié)果

          短的研發(fā)周期可快速投放市場產(chǎn)生利潤

          很少的樣本檢測程序

          滿足即時(shí)檢測和床邊檢測

          可以檢測物質(zhì)種類繁多，包括蛋白、半抗原、核酸、擴(kuò)增產(chǎn)物等

          較好的滿足單人份檢測和中等批量的檢測量

          長的產(chǎn)品效期，不需要冰箱，可提前備貨

          對(duì)于液體的樣本，幾乎不需要前處理或者僅需要離心

缺點(diǎn)：

          不精確的加樣量減少準(zhǔn)確度（滴管、毛細(xì)采血管等）

          人工操作步驟較多，存在誤差

          樣本的加樣量少是限制敏感性的一個(gè)因素

          顯示信號(hào)沒有經(jīng)過酶等二次放大

          結(jié)果判讀采用比色卡或圖形掃描、讀條儀、CCD，存在影響

          對(duì)原材料抗體或抗原等要求較高

          分析時(shí)間取決于樣本的性質(zhì)和粘度

          膜的孔徑結(jié)構(gòu)，膜孔徑大小有差異的阻礙，造成精密性差異

          非液體樣本需要前處理          

4、側(cè)向?qū)游隹ò宓慕Y(jié)構(gòu)（以膠體金免疫層析（雙抗體夾心法）為例）。

5、膠體金技術(shù)簡介

膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，有其*的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記。同時(shí)在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生物芯片中都得到了廣泛的應(yīng)用。

膠體金也稱金溶膠，是金鹽被還原成子金后形成的金顆粒懸液，膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。

膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。

6、膠體金常用檢測技術(shù)

6.1、快速膠體金免疫滲濾法（80年代）

主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。

6.2、膠體金免疫層析法（90年代）

免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用(基于層析作用的橫流)向另一端移動(dòng)。移動(dòng)過程中被分析物與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結(jié)合而被固相化，無關(guān)物質(zhì)則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標(biāo)記物顯色來判定試驗(yàn)結(jié)果。

6.3、免疫膠體金光鏡染色法

細(xì)胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記，使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。

6.4、免疫膠體金電鏡染色法

可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合，然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。

6.5、快速金標(biāo)試劑技術(shù)

是將特異的抗體先固定于酸類纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的酸類纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合。同時(shí)利用金粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處。當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色的斑點(diǎn)。既為快速的金標(biāo)檢測方法原理。生產(chǎn)快速而精確試劑，要點(diǎn)在于所采用的單克隆抗體、多元克隆抗體、抗原、半抗原、蛋白嵌合物及膠體金等原料的靈敏性及特異性等是否能達(dá)到最高的標(biāo)準(zhǔn)，此為金標(biāo)試劑的質(zhì)量之重要的標(biāo)準(zhǔn)。

目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于檢測 HBsAg、HCG 和抗雙鏈DNA抗體等，具有簡單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)。

7、膠體金免疫滲濾技術(shù)

技術(shù)原理：膠體金免疫滲濾技術(shù)也采用膠體金作為示蹤物，基于抗原和抗體結(jié)合的原理，不同之處在于滲濾技術(shù)層析方向是垂直的。

8、膠體金免疫層析技術(shù)

8.1、膠體金免疫層析技術(shù)也是膠體金免疫色譜技術(shù)，是20世紀(jì)80-90年代，在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的體外診斷技術(shù)，英文全稱Colloidal Gold Immunochromatoaraphy Assay，縮寫GICA。

8.2、膠體金免疫層析技術(shù)發(fā)展歷程

1971年，F(xiàn)aulk和Taylor發(fā)明了膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法，應(yīng)用于免疫組化；

1973年，F(xiàn)rens G發(fā)明了檸檬酸鈉還原氯金酸制備膠體金的方法；

1984年，第一次用膠體金在NC膜上實(shí)現(xiàn)了抗原的可視化檢測；

20世紀(jì)80年代后期，第一次用膠體金在NC膜上實(shí)現(xiàn)了抗原的可視化檢測。

8.3、膠體金免疫層析技術(shù)有三種反應(yīng)模式：雙抗體夾心法、間接法、競爭抑制法。

雙抗體夾心法：雙抗體夾心法主要用于大分子量蛋白（抗原）的檢測。要求兩株抗體針對(duì)一個(gè)抗原的不同位點(diǎn)才可以，例如FABP、cTnI、CK-MB等檢測項(xiàng)目。也有個(gè)別項(xiàng)目是雙抗原夾心檢測抗體的，原理類似。

間接法：間接法主要用于血清中抗體檢測，純化或者重組的抗原固定于NC膜上，標(biāo)記大多為蛋白A，例如HIV、人狂犬病毒IgG檢測試劑盒(膠體金法)等。間接法要求金標(biāo)蛋白過量，一般來說樣品在加入之前需要稀釋。膠體金免疫滲濾技術(shù)一般使用的就是間接法。

競爭法：競爭法主要用于小分子抗原（d品、農(nóng)藥、肽鏈）的檢測。由于小分子抗原不能直接固定于NC膜上，常常用化學(xué)方法把小分子偶聯(lián)到BSA等大分子物質(zhì)上再固定于NC膜上。此結(jié)果判讀方法與夾心法和間接法相反，陽性是只有C線顯現(xiàn)，陰性是CT線都有。

9、基于顯色原理的層析技術(shù)

10、分子發(fā)光原理

S0：基態(tài)；S1：第一電子激發(fā)單重態(tài)；S2：第二電子激發(fā)單重態(tài)；T1：第一電子激發(fā)三重態(tài)；T2：第二電子激發(fā)三重態(tài)。

室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的低振動(dòng)能級(jí)。處于基態(tài)的分子吸收能量后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，返回基態(tài)時(shí)伴隨著光子的輻射，此即為“發(fā)光"。

由激發(fā)單重態(tài)低振動(dòng)能級(jí)躍遷回基態(tài)，并伴隨光子的輻射，稱為“熒光發(fā)射"；

由激發(fā)三重態(tài)低振動(dòng)能級(jí)躍遷回基態(tài)，并伴隨著光子的輻射，稱為“磷光發(fā)光"。

11、熒光免疫層析簡介

反應(yīng)原理：免疫層析；

標(biāo)記物：熒光物質(zhì)；

檢測對(duì)象：T線及C線熒光強(qiáng)度。

熒光物質(zhì)的要求：

熒光信號(hào)強(qiáng)度高，摩爾消光系數(shù)大；

斯托克斯位移大；

激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄；

熒光壽命長，熒光信號(hào)穩(wěn)定。

12、磁免疫層析技術(shù)簡介

磁性免疫層析，指的是利用超順磁性納米微球代替膠體金等常規(guī)材料構(gòu)建的一種基于免疫層析的試紙條，并利用磁信號(hào)檢測儀對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測的方法。

優(yōu)勢：

生物樣本中沒有磁性材料，沒有本底干擾；

磁信號(hào)可以傳過NC膜，可以檢測整個(gè)條帶的磁信號(hào)。