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T淋巴細(xì)胞的分離技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：304 發(fā)布時(shí)間：2016-12-27
（一）原理
混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細(xì)胞則通過尼龍毛柱，這是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。
（二）材料及試劑
1．尼龍毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）。
2．燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。
3．裝填尼龍毛柱，一次性注射器。
4．取自然沉降的上層血漿，過聚蔗糖—*分層液后，獲取的血漿和分層液之間的單個(gè)核細(xì)胞層。
（三）操作方法
1．尼龍毛的清洗與干燥
（1）戴上已經(jīng)洗去*的一次性手套，將尼龍毛（1包或2包，每包35g）放入燒杯中，加入蒸餾水或去離子水，用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。
（2）冷卻至常溫，倒入漏斗內(nèi)，使水滴干。
（3）重復(fù)（1）、（2）步驟6次。
（4）將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內(nèi)，37℃溫箱干燥2～3天后，貯藏在帶蓋的方盤內(nèi)。
2．裝尼龍毛柱
（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。
（2）將尼龍毛梳理，并適當(dāng)折疊，以適應(yīng)注射器的直徑，填入注射器內(nèi)，約20ml的體積。
（3）將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好，高壓滅菌。
3．細(xì)胞分離
（1）將注射器固定在支架上，倒入37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液，關(guān)閉閥門一定時(shí)間，然后打開閥門，放掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以清洗幾次尼龍毛，關(guān)上閥門。
（2）將要分離的細(xì)胞液用預(yù)先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?，約5.00×107個(gè)細(xì)胞／ml。
（3）將細(xì)胞液倒入注射器內(nèi)，使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器，37℃溫育45min
至1h。
（4）打開下口，緩慢放流（1滴／min），收集于離心管中。
（5）離心，即獲所需的T淋巴細(xì)胞。
（6）關(guān)閉注射器下口，于注射器內(nèi)加入0.85％冰冷生理鹽水，振蕩，并套上注射器芯，打開下口，使勁推出注射器內(nèi)液體，即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。
（四）注意事項(xiàng)
1．此種分離法，T淋巴細(xì)胞也常有一部分被吸附，吸附的多少與尼龍毛的質(zhì)量有關(guān)，與裝柱的松緊也有關(guān)系。
2．此法的T淋巴細(xì)胞的回收率約20％～30％。
3．用過的尼龍毛可回收，以鹽水洗滌，然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜，然后再同前法清洗。