小鼠糖蛋白130（gp130）酶聯(lián)免疫試劑盒

英文名： Mouse glucoprotein 130,gp130 ELISA KIT 

操作方法：

雙抗體夾心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。

3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

間接法

1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜；

2.次日洗滌3次；

3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌；

4.（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml；

5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌；

6.’zui后一遍用DDW洗滌。

其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

注意事項(xiàng)：

1）在收集標(biāo)本前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃，必須清楚要檢測(cè)的成份是否足夠穩(wěn)定。

2）我們提倡新鮮標(biāo)本盡早檢測(cè)，對(duì)收集后及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。1-3天左右檢測(cè)的樣本可儲(chǔ)存在4℃備用。如有特殊原因需要周期性收集標(biāo)本，請(qǐng)將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或- 70℃條件下保存，避免反復(fù)凍融。

液體類標(biāo)本：

包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。

1）血清：

室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

2）血漿：

應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

3）尿液：

用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。

4）細(xì)胞培養(yǎng)上清：

A、檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/ 分）。仔細(xì)收集上清。

B、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并 放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5）組織標(biāo)本：

切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

植物葉片的處理方法：

新鮮葉片加PBS研磨，離心，取上清，PBS濃度為0.01mol，PH值是7.4，轉(zhuǎn)速2500-3500轉(zhuǎn)，10分鐘左右
葉片采好放在2-8度就可以了，可以放置一周。處理好了再放到-20保存。取一克樣本，用5mlPBS勻漿取上清，PBS為0.01M，pH為7.4的

基本操作就是取糞便500ug-1g加入2-5ml的PBS，充分勻漿（百分之20）
PBS的PH值是：7.4  PBS濃度是0.01mol

注：本試劑只能用于科研，不能臨床。

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