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人糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)ELISA試劑盒

時間:2016/1/12閱讀:352
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人糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供科研使用。

本試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本中糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)的含量。

有效期:6個月

保存條件:2-8

 

實驗原理

   本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)水平。用純化的人糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR),再與HRP標記的糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中人糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)濃度。

試劑盒組成

 

試劑盒組成

96孔配置

保存

1

說明書

1

 

2

封板膜

2片(96)

 

3

密封袋

1

 

4

酶標包被板

1×96

2-8℃保存

5

標準品:270pg/ml

0.5ml×1瓶

2-8℃保存

6

標準品稀釋液

1.5ml×1瓶

2-8℃保存

7

酶標試劑

6 ml×1瓶

2-8℃保存

8

樣品稀釋液

6 ml×1瓶

2-8℃保存

9

顯色劑A液

6 ml×1瓶

2-8℃保存

10

顯色劑B液

6 ml×1瓶

2-8℃保存

11

終止液

6ml×1瓶

2-8℃保存

12

濃縮洗滌液

(20ml×30倍)×1瓶

2-8℃保存

樣本處理及要求

1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應再次離心。

2. 血漿:應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。

3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

操作步驟

  1. 標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在*、第二孔中分別加標準品100μl,然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為180pg/ml,120pg/ml,60pg/ml,30 pg/ml,15pg/ml)。

 

    
  
 

270 pg/ml

 

 

 

 

 

 

  1. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
  2. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
  3. 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
  4. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。
  5. 加酶:每孔加入酶標試劑50ul,空白孔除外。
  6. 溫育:操作同3。
  7. 洗滌:操作同5。
  8. 顯色:每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑B50ul,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
  9. 終止:每孔加終止液50ul,終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。
  10. 測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

注意事項

1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。

  1. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。
  2. 各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,*使用排槍加樣。
  3. 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
  4. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
  5. 底物請避光保存。
  6. 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
  7. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
  8. 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。

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