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人白細(xì)胞介素-8(IL-8)酶聯(lián)免疫試劑盒

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白細(xì)胞介素-8(IL-8)酶聯(lián)免疫試劑盒使用說明





本試劑盒適用于以下樣本的測試(黑底字體為適用樣本):


血清、血漿- 組織勻漿 腹水 細(xì)胞培養(yǎng)上清








本試劑盒僅供研究,不用于臨床診斷



目錄

  1. 實驗原理
  2. 試劑盒組成
  3. 試劑盒保存
  4. 需要而未提供的試劑和器材
  5. 樣本前處理
  6. 洗板方法
  7. 詳細(xì)操作程序
  8. 操作總結(jié)
  9. 性能參數(shù)












  1. 實驗原理:本試劑盒采用的是*雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定樣品中人白細(xì)胞介素-8(IL-8)的水平。向預(yù)先包被了人白細(xì)胞介素-8(IL-8)單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入白細(xì)胞介素-8(IL-8),溫育;溫育后,加入*標(biāo)記的抗IL-8抗體,再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合,形成免疫復(fù)合物,再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶,然后加入底物A、B,產(chǎn)生藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中人白細(xì)胞介素-8(IL-8)的濃度呈正相關(guān)。






2.試劑盒組成:

1

標(biāo)準(zhǔn)品(400 ng/L

0.5ml

7

顯色劑A

3ml

2

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

3ml

8

顯色劑B

3ml

3

酶標(biāo)包被板

12孔×4

9

終止液

3ml

4

鏈霉親和素-HRP

3ml

10

說明書

1

5

20倍濃縮洗滌液

20ml

11

封板膜

2

6

*標(biāo)記的抗- IL-8抗體

1ml

12

密封袋

1


3.試劑盒保存

  • 2-8℃下保存6個月,在-20℃下可以保存更長的時間。酶標(biāo)板為真空包裝,板條可以拆卸,拆開以后如一次不能用完,請放入提供的密封袋中,放入干燥劑,2-8℃保存,在一個月之內(nèi)仍然有效。試劑不能反復(fù)凍融。

4需要而未提供的試劑和器材

  1. 37℃恒溫箱。
  2. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
  3. 精密移液器及一次性吸頭
  4. 雙蒸水或超純水
  5. 干凈的試管或Eppendof管
  6. 吸水紙








5樣本前處理

  1. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融
    b.血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。
    c.血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
    d.尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
    e.細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
    f.組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。
  2. 洗板方法
  1. 手工洗板:先洗去酶標(biāo)孔中的的液體,在吸水紙上拍干,然后每孔加入300μl稀釋好的洗滌液,輕輕搖晃30秒,然后甩掉,在吸水紙上拍干,重復(fù)4-5次。
  2. 洗板機洗板:洗板機洗板比較便捷,但應(yīng)操作熟練后使用。
  3. 詳細(xì)操作程序
  1. 使用前請先將試劑盒在室溫下平衡半小時。
  2. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:(本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋):

200 ng/L

5號標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

100 ng/L

4號標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl5號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

50ng/L

3號標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl4號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

25 ng/L

2號標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl3號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

12.5 ng/L

1號標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl2號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

  1. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
  2. 加樣:1)空白孔:空白對照孔不加樣品,*標(biāo)記的抗IL-8抗體,鏈霉親和素-HRP,只加顯色劑A&B和終止液,其余各步操作相同;2)標(biāo)準(zhǔn)品孔:加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl,*-HRP50μl(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好*抗體,故不加);3)待測樣品孔:加入樣本40μl,然后各加入- IL-8抗體10μl、鏈酶親和素-HRP50μl,蓋上封板膜,輕輕振蕩混勻,37溫育60分鐘。
  3. 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
  4. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
  5. 顯色:每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37避光顯色10分鐘。
  6. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
  7. 測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

9.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。

  1. 操作總結(jié)

準(zhǔn)備試劑,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

 


加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,*標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑,37℃反應(yīng)60分鐘


洗板5次,加入顯色液A、B,37℃顯色10分鐘


加入終止液


10分鐘之內(nèi)讀OD值


計算

  1. 性能參數(shù)
  1. 批內(nèi)差:CV10%
  2. 批間差:CV12%
  3. 檢測范圍1ng/L→380ng/L

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