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大鼠NADPH氧化酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用說明書

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大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)酶聯(lián)免疫檢測(cè)

試劑盒使用說明書

 

使用前仔細(xì)閱讀本說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于*雙抗體夾心技術(shù)原理,來檢測(cè)大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)),只能用于研究用途,不得用于醫(yī)學(xué)診斷。

 

用    途: 用于大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中NADPH氧化酶(NADPH-OX)的測(cè)定。

工作原理

本試劑盒采用的是*雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定樣品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的水平。向預(yù)先包被了大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入NADPH氧化酶(NADPH-OX),溫育;溫育后,加入*標(biāo)記的抗NADPH-OX抗體,再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合,形成免疫復(fù)合物,再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶,然后加入底物A、B,產(chǎn)生藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的濃度呈正相關(guān)。

試劑盒組成

1

標(biāo)準(zhǔn)品(3200pg/ml

0.5ml

7

顯色劑A

3ml

2

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

3ml

8

顯色劑B

3ml

3

酶標(biāo)包被板

12孔×4

9

終止液

3ml

4

鏈霉親和素-HRP

3ml

10

說明書

1

5

20倍濃縮洗滌液

20ml

11

封板膜

2

6

*標(biāo)記的抗- NADPH-OX抗體

1ml

12

密封袋

1個(gè)

需要而未提供的試劑和器材

  1. 37℃恒溫箱。
  2. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
  3. 精密移液器及一次性吸頭
  4. 蒸餾水,
  5. 一次性試管
  6. 吸水紙

注意事項(xiàng)

  1. 從2-8℃取出的試劑盒,在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
  2. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。
  3. 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
  4. 為避免交叉污染,要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜
  5. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
  6. 底物B對(duì)光敏感,避免長時(shí)間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法:甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。

自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

 

標(biāo)本要求

1不能檢測(cè)含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

2.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融

操作程序

  1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:(本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶請(qǐng)按照說明自行在小試管中倍比稀釋):

160 pg/ml

5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

800 pg/ml

4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

400 pg/ml

3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

200 pg/ml

2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

100 pg/ml

1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

120μl2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

  1. 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
  2. 加樣:1)空白孔:空白對(duì)照孔不加樣品,*標(biāo)記的抗NADPH-OX抗體,鏈霉親和素-HRP,只加顯色劑A&B和終止液,其余各步操作相同;2)標(biāo)準(zhǔn)品孔:加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl,*-HRP50μl(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好*抗體,故不加)3)待測(cè)樣品孔:加入樣本40μl,然后各加入- NADPH-OX抗體10μl、鏈酶親和素-HRP50μl,蓋上封板膜,輕輕振蕩混勻,37溫育60分鐘。
  3. 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
  4. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
  5. 顯色:每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37避光顯色10分鐘。
  6. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
  7. 測(cè)定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

9.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。

操作程序總結(jié)

準(zhǔn)備試劑,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

 

 

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,*標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑,37℃反應(yīng)60分鐘

 

洗板5次,加入顯色液A、B,37℃顯色10分鐘

 

加入終止液

 

10分鐘之內(nèi)讀OD值

 

計(jì)算

 

檢測(cè)范圍:10 pg/ml→300pg/ml

規(guī)格:    48T/

保存:    2-8℃

有效期:  6個(gè)月(2-8℃)。

 

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