1、一般培養(yǎng)——保持胚胎干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)
　　
　　培養(yǎng)基
　　
　　細(xì)胞復(fù)蘇
　　
　　凍存細(xì)胞
　　
　　明膠包被
　　
　　細(xì)胞傳代
　　
　　2、體外分化
　　
　　培養(yǎng)基：包被有多聚*/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
　　
　　體外分化方法
　　
　　注：以下培養(yǎng)針對(duì)于小鼠的R1胚胎干細(xì)胞系，其它胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)可以參考。不過(guò)人的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)不可以采用下面的protocol，需要用的protocol和培養(yǎng)基。
　　
　　一般培養(yǎng)——維持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)
　　
　　ES細(xì)胞培養(yǎng)用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed細(xì)胞的培養(yǎng)基（高糖）來(lái)阻止細(xì)胞的分化。為細(xì)胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細(xì)胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達(dá)到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細(xì)胞一次，細(xì)胞傳代以后，在將細(xì)胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過(guò)預(yù)先將細(xì)胞接種在沒(méi)有經(jīng)過(guò)包被的組織培養(yǎng)板2個(gè)小時(shí)，使分化細(xì)胞粘附，從而將分化和未分化細(xì)胞分開(kāi)。將細(xì)胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。如果在Feed細(xì)胞，那么就需要采用MMC進(jìn)行處理，抑制Feed細(xì)胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活*。下文中暫不提及Feed細(xì)胞。Feed細(xì)胞可以來(lái)源于STO細(xì)胞或原代胚胎成纖維細(xì)胞。
　　
　　培養(yǎng)基
　　
　　ES：配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見(jiàn)下文）。分裝在50ml離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過(guò)將21ml該溶液，HS和LIF加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.22μm濾膜過(guò)濾。貯存于4℃，時(shí)間不要超過(guò)2周。
　　
　　貯存液
　　
　　DMEM（高糖）
　　
　　馬血清（HS）
　　
　　L-*（200mM）
　　
　　MEMNEAA（10mM）
　　
　　HEPES（1M）
　　
　　β-巰基乙醇（55Mm）
　　
　　PEST
　　
　　LIF
　　
　　復(fù)蘇細(xì)胞
　　
　　細(xì)胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會(huì)損害細(xì)胞。然而，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞有毒*，快速的進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇是很重要的。
　　
　　步驟：
　　
　　1、從液氮中取出一管細(xì)胞；
　　
　　2、將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好*溶解）；
　　
　　3、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一15mlFalcon管中；
　　
　　4、加入5mlES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；
　　
　　5、離心3分鐘；
　　
　　6、棄上清，用2mlES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，至少吹打10次；
　　
　　7、種在明膠包被（見(jiàn)下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；
　　
　　8、孵育。
　　
　　凍存細(xì)胞
　　
　　凍存液：90％HS和10％DMSO
　　
　　步驟：
　　
　　1、1×PBS洗細(xì)胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；
　　
　　2、用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞；
　　
　　3、將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管管內(nèi)并離心3分鐘；
　　
　　4、棄去上清并將細(xì)胞重懸于冷的凍存液中（10cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。）
　　
　　5、分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml；
　　
　　6、置－80℃過(guò)夜，第二天移入液氮。
　　
　　Geltin（明膠）包被
　　
　　準(zhǔn)備500ml0.1％geltin溶液
　　
　　1、將0.5g明膠溶解在500ml無(wú)鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）。
　　
　　2、在溶液沒(méi)有冷卻的情況下通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，貯存在4℃。
　　
　　包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
　　
　　1、加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15cm培養(yǎng)皿加2ml，10cm培養(yǎng)皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能*覆蓋培養(yǎng)表面就行了。）；
　　
　　2、置室溫30分鐘；
　　
　　3、去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，將板子平放或倒扣，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。
　　
　　細(xì)胞傳代
　　
　　建議每2天傳代細(xì)胞一次，過(guò)度生長(zhǎng)的細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來(lái)去除分化細(xì)胞，在將細(xì)胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前，通過(guò)將分化細(xì)胞黏附在沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細(xì)胞。
　　
　　純化步驟包含在下面的方法中。
　　
　　1、去除培養(yǎng)液；
　　
　　2、無(wú)鈣鎂PBS（Gibco）洗滌；
　　
　　3、加入*EDTA（Gibco）。37℃孵育5分鐘。
　　
　　4、加入ES培養(yǎng)基使*失活；
　　
　　5、將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中離心3min；
　　
　　6、去除上清，將細(xì)胞重懸于2mlES培養(yǎng)基，至少吹打10－20次。如果加入培養(yǎng)基的量較少會(huì)比較容易將細(xì)胞團(tuán)弄散分開(kāi)。ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向，傳代過(guò)程中仔細(xì)將細(xì)胞弄散分開(kāi)很重要。這樣可能會(huì)減少細(xì)胞的自然分化。
　　
　　7、將細(xì)胞接種在沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開(kāi)始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時(shí)（分化細(xì)胞在該時(shí)間內(nèi)將黏附，而ES細(xì)胞仍將保持懸?。?；
　　
　　8、含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入geltin包被的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細(xì)胞被分散開(kāi)（前面已經(jīng)提到--ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向）
　　
　　9、建議按1：4－1：10的比率傳代(ATCC)
　　
　　保持細(xì)胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗(yàn)，1：8的比率是好的，可以使細(xì)胞的自然分化降到zui低。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞傳代可以使用表1來(lái)計(jì)算傳代比率。
　　
　　體外分化
　　
　　胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)外可以分化為各種類(lèi)型的細(xì)胞。我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細(xì)胞通過(guò)在zui少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴(kuò)增（第4步）并zui終分化在第5步。細(xì)胞全程培養(yǎng)在37℃，5％CO2，100％濕度條件下。一般體外誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，也可以采用低濃度的RA進(jìn)行誘導(dǎo)。
　　
　　時(shí)間線（總時(shí)間為27～34天）
　　
　　第2步；4＋1天第3步；4－10天第4步；4天第5步；10－15天
　　
　　體外向心肌細(xì)胞方向分化
　　
　　胚胎干細(xì)胞在體外去除LIF情況下會(huì)自然向心肌細(xì)胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出現(xiàn)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞，與胚胎發(fā)育時(shí)間線是*一致的。
　　
　　培養(yǎng)基
　　
　　EB
　　
　　配制一20×不含DMEM，F(xiàn)BS，LIF的溶液（該溶液也能用于ES培養(yǎng)基--見(jiàn)前述）。分裝在50ml離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。將21ml該溶液和50mlFBS加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過(guò)濾。貯存于4℃。
　　
　　貯存液
　　
　　DMEM(高糖)
　　
　　胎牛血清
　　
　　L-*（200mM）
　　
　　MEMNEAA（10mM）
　　
　　HEPES（1M）
　　
　　β-巰基乙醇（55Mm）
　　
　　PEST（P104U/mlS104μg/ml
　　
　　ITSFnandN3（分化培養(yǎng)基）：
　　
　　配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml離心管中，（稀釋為1×，ITSFn7.05ml，N312.55ml），0.2μm濾膜過(guò)濾，貯存在-20℃。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養(yǎng)基，貯存于4℃。
　　
　　貯存液
　　
　　DMEM(高糖)
　　
　　轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml
　　
　　胰島素5mg/ml
　　
　　ya硒酸na300μM
　　
　　huang體酮（20μM）
　　
　　腐胺（100μM）
　　
　　PEST（P104U/mlS104μg/ml）
　　
　　層粘連蛋白100μg/ml
　　
　　纖維連接蛋白250μg/ml
　　
　　堿*rhFGF,10μg/ml
　　
　　*在第4步將bFGF加入N3培養(yǎng)基使終濃度為10ng/ml。
　　
　　ITSFnandN3培養(yǎng)基貯存液的準(zhǔn)備
　　
　　使用無(wú)菌的溶劑和稀釋液，在分裝之前要對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾，如果因?yàn)槟承┰蛉芤涸诜盅b之前沒(méi)有進(jìn)行過(guò)濾，需要在管子上標(biāo)明以便別人在使用時(shí)知道該溶液不能直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。
　　
　　貯存液溶劑，貯存液，稀釋劑和儲(chǔ)存
　　
　　轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml
　　
　　胰島素5mg/ml
　　
　　ya硒shuang鈉300μM
　　
　　huang體酮（20μM）
　　
　　腐胺（100μM）
　　
　　PEST（P104U/mlS104μg/ml）
　　
　　層粘連蛋白（100μg/ml）
　　
　　纖維連接蛋白（250μg/ml）
　　
　　堿*rhFGF,（10μg/ml）
　　
　　包被有多聚*/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
　　
　　包被液的準(zhǔn)備
　　
　　多聚-L-賴(lài)氨酸，15μg/ml
　　
　　把75ml多聚-L-賴(lài)氨酸和425ml1×PBS混合。貯存在4℃。
　　
　　纖維結(jié)合蛋白，1μg/ml
　　
　　把0.5ml纖維結(jié)合蛋白和500ml1×PBS混合。
　　
　　包被過(guò)程：
　　
　　1、加入多聚-L-賴(lài)氨酸，至少2－3小時(shí)（過(guò)夜也行）
　　
　　2、吸出多聚-L-賴(lài)氨酸
　　
　　3、加入纖維結(jié)合蛋白，大約1－2小時(shí)
　　
　　4、吸出纖維結(jié)合蛋白，放置30分鐘晾干
　　
　　5、貯存在4℃
　　
　　24孔板用200μl，6孔板用500μl。震蕩培養(yǎng)板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養(yǎng)孔。有時(shí)需要?jiǎng)×艺鹗幣囵B(yǎng)板。
　　
　　體外分化方法
　　
　　第1步：ES培養(yǎng)基
　　
　　在LIF存在的條件下維持細(xì)胞培養(yǎng)
　　
　　第2步：EB培養(yǎng)基
　　
　　使用細(xì)菌培養(yǎng)皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
　　
　　1、分散純化細(xì)胞（參見(jiàn)上面的細(xì)胞傳代部分）
　　
　　2、純化2小時(shí)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50mlFalcon管中，計(jì)數(shù)細(xì)胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。
　　
　　3、用2mlEB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打至少10次制成單細(xì)胞懸液
　　
　　4、一個(gè)15cm的細(xì)菌培養(yǎng)皿接種4～5×106個(gè)細(xì)胞（1個(gè)*融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接種4個(gè)同樣規(guī)格的細(xì)菌培養(yǎng)皿）。
　　
　　5、2天后更換培養(yǎng)基
　　
　　將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘使細(xì)胞沉降。棄去上清，將細(xì)胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并接種在新的細(xì)菌培養(yǎng)皿中。
　　
　　6、用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)皿中（這即是細(xì)胞的移植步驟）。1個(gè)組織培養(yǎng)皿之中放置1個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)皿，在進(jìn)行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規(guī)格的培養(yǎng)板上。
　　
　　形成胚狀體需要4天時(shí)間。在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)1天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的表面。這一天被認(rèn)為是第2步和第3步的分界。
　　
　　第3步：ITSFn培養(yǎng)基
　　
　　在zui少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細(xì)胞
　　
　　1、胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn培養(yǎng)基。
　　
　　2、并非所有胚狀體在這一時(shí)期都已經(jīng)發(fā)生粘附，因此在移除培養(yǎng)基時(shí)要小心謹(jǐn)慎以使大部分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。
　　
　　3、保持細(xì)胞在ITSFn中培養(yǎng)大約10天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基--大約每隔一天。
　　
　　觀察細(xì)胞形態(tài)，神經(jīng)樣細(xì)胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當(dāng)神經(jīng)樣細(xì)胞能夠被鑒別時(shí)，轉(zhuǎn)入到第4步。步驟的轉(zhuǎn)換應(yīng)該在神經(jīng)前體細(xì)胞出現(xiàn)*個(gè)清晰的標(biāo)志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
　　
　　第4步：N3培養(yǎng)基＋bFGF
　　
　　通過(guò)將神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)在含有10ng/mlbFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。
　　
　　1、PBS洗滌，加入1-2ml*
　　
　　2、37℃孵育5分鐘
　　
　　3、用4mlEB培養(yǎng)基終止*活*，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘移出細(xì)胞團(tuán)，將上清移入一新的離心管離心。
　　
　　4、將細(xì)胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。
　　
　　5、將細(xì)胞接種在包被多聚-L-*/纖維連接蛋白的蓋玻片上（將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個(gè)蓋玻片如果是塑料的放置4個(gè)，以使zui大可能的獲得樣品數(shù)量）。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
　　
　　6、2天后更換培養(yǎng)基
　　
　　第5步：N3培養(yǎng)基通過(guò)撤除bFGF使神經(jīng)前體細(xì)胞分化
　　
　　1、細(xì)胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基
　　
　　2、根據(jù)需要換液（大約每隔一天）
　　
　　3、分化10～15天后固定細(xì)胞
　　
　　移除培養(yǎng)基
　　
　　PBS洗滌
　　
　　加入4%福爾馬林
　　
　　室溫放置30分鐘
　　
　　PBS洗滌2次
　　
　　儲(chǔ)存于PBS。長(zhǎng)期儲(chǔ)存使用含0.01％疊氮化納的PBS
　　
　　移植細(xì)胞的準(zhǔn)備
　　
　　細(xì)胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應(yīng)于體外分化過(guò)程中的第2步末細(xì)胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開(kāi)始形成胚狀體。通常再需要一天時(shí)間以便將胚狀體移植入一10cm的培養(yǎng)皿。
　　
　　移植
　　
　　1、將胚狀體轉(zhuǎn)移至一15ml圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來(lái)。
　　
　　細(xì)胞被離心3分鐘會(huì)更好。放置使之沉降將會(huì)去除更多的單個(gè)細(xì)胞（包括死細(xì)胞）而這些細(xì)胞可以被離心下來(lái)。
　　
　　2、去除上清將胚狀體重懸于無(wú)鈣鎂離子的1×PBS中
　　
　　3、離心3分鐘
　　
　　4、去除上清加入1×*（10cm的培養(yǎng)皿加1ml）
　　
　　5、37℃水浴5分鐘
　　
　　6、加入5mlEB培養(yǎng)基小心吹打約10次
　　
　　小心處理細(xì)胞很重要，進(jìn)行細(xì)胞傳代分散細(xì)胞時(shí)不可劇烈吹打。
　　
　　7、離心2分鐘
　　
　　8、吸出上清將細(xì)胞重懸于500μlEB培養(yǎng)基
　　
　　9、用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
　　
　　10、離心2次
　　
　　11、吸出上清將細(xì)胞重懸于100μlEB培養(yǎng)基
　　
　　*己可堿標(biāo)記ES細(xì)胞進(jìn)行移植
　　
　　1、準(zhǔn)備一10μg/ml的*已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）
　　
　　2、加入1mg（你能稱(chēng)到的zui小量）到5mlEB培養(yǎng)基（制成200μg/ml）
　　
　　3、將溶液稀釋成10μg/ml（100μl200μg/ml溶液和1.9mlEB培養(yǎng)基）
　　
　　4、如前所述將細(xì)胞重懸于2ml*已可堿染液而不是EB培養(yǎng)基中制備ES細(xì)胞懸液
　　
　　5、將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘
　　
　　6、離心2分鐘
　　
　　7、吸出上清將細(xì)胞重懸于2mlEB培養(yǎng)基
　　
　　8、重復(fù)一次
　　
　　9、離心2分鐘
　　
　　10、吸出上清將細(xì)胞重懸于100μlEB培養(yǎng)基并置于冰上。
　　
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