細胞培養(yǎng)常用設備及實驗技巧（二）

時間：2014-3-11閱讀：400

細胞的復蘇

細胞復蘇的原則——快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

具體操作

一、實驗前準備：

1.將水浴鍋預熱至37℃。

2.用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

二、取出凍存管：

1.根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

三、迅速解凍：

1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

2.約1～2min后凍存管內液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。

四、平衡離心：

用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min離心3min。

五、制備細胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向離心管內加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。

六、細胞計數(shù)：

細胞濃度以5×10⁵/ml為宜。

七、培養(yǎng)細胞

將復合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5%CO₂的培養(yǎng)箱內2～4小時（或者24～48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。

初學者易犯錯誤：

1.水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。

2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。

3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。

4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。

細胞計數(shù)

實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。

具體操作：

一、準備工作：

取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。

二、細胞懸液制備：

細胞懸液的制備方法是用0.25%的*液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等*），吹打制成待測細胞懸液。

三、細胞計數(shù)：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。

2.制備計數(shù)用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液（0.4%）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。

3.將細胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4.統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數(shù)目。

5.計算原細胞懸液的細胞數(shù)：按照下面公式計算細胞密度：

（細胞懸液的細胞數(shù)）/ml=（四個大格子細胞數(shù)/4）×2×10⁴

說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。

公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以10⁴因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm³，而1ml=1000mm³

四、細胞計數(shù)要點：

1.進行細胞計數(shù)時，要求懸液中細胞數(shù)目不低于10⁴個/ml，如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。

2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。

3.取樣計數(shù)前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準確。

4. 數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。

5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。

五、初學者易犯的錯誤：

1. 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

3. 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

六、本實驗特殊試劑的配制：

4%臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。

使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4%即可。

細胞的凍存

1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

2.接著置于-20℃冰箱，約30～60min。

3.置于-80℃超低溫冰箱中放置過夜。

4.置于液氮罐中長期保存。

5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項：

1.使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時戴上手套操作。

2.不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內，是“危險溫區(qū)”。

3.注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。