實(shí)驗(yàn)步驟

1. 大鼠以3％戊*鈉60mg/kg麻醉后，依次碘酒、乙醇消毒；

2. 以十字型切口打開腹腔，暴露內(nèi)臟，將腸管推向腹腔的左側(cè)，暴露出下腔靜脈和門靜脈，首先游離出下腔靜脈，將膽總管結(jié)扎。然后分離門靜脈，將其分支一一結(jié)扎，并在門靜脈的近端和遠(yuǎn)端分別預(yù)置“0”號(hào)絲線一根，用針管內(nèi)預(yù)先吸有肝素的l8號(hào)*穿刺門靜脈，退出針芯，見門靜脈有回血后結(jié)扎固定，迅速接通灌注系統(tǒng)，并剪開下腔靜脈建立流出道，以20ml/min的速率灌注預(yù)灌注液（37℃），同時(shí)將肝臟完整地分離下來(lái)，置入一平皿中；

3. 灌注約10 min后，肝臟*變?yōu)榈S褐色，關(guān)閉預(yù)灌注液三通開關(guān)，以15 ml／min速率灌注50 ml（25 mg）鏈蛋白酶E灌注液，然后再以15 ml／min速率灌注含Ⅳ型膠原酶的灌注液（37℃）；

4. 將一根一次性輸液管一端浸入培養(yǎng)皿液面以下，另一端插入*瓶，建立膠原酶的循環(huán)灌注；

5. 20～25 min后，當(dāng)肝臟組織*變軟，撕去肝包膜，去除結(jié)締組織，鈍性粉碎肝組織制備細(xì)胞懸液；

6. 將細(xì)胞懸液倒入一預(yù)先裝有100 ml、37℃預(yù)熱的振蕩消化液硅化三角燒瓶中，將三角燒瓶放恒溫振蕩器中振蕩消化30 min （200 r／min，37℃），振蕩消化后的細(xì)胞懸液依次經(jīng)120目、300目鋼網(wǎng)過(guò)濾，收集于2個(gè)50ml聚丙烯離心管中；

7. 1700 r／min離心5 min（4℃），吸棄上清液。每管加入40 ml RPMI 1640液，反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分懸??；

8. 200 r/min離心2 min （20℃）2次，使細(xì)胞懸液中剩余的肝細(xì)胞沉淀，去除肝細(xì)胞；

9. 上清液l 700 r／min離心5 min（4℃），沉淀肝的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，吸棄上清液，用RPMI 1640液1700 r／min離心5 min（4℃）再?zèng)_洗2～3次；

10. 將33％的Histodenz液以RPMI 1640液稀釋成為11％ Histodenz液，加入l1％ Histodenz液重懸細(xì)胞沉淀，反復(fù)輕柔吹打，使細(xì)胞充分懸??；

11. 配制15％的Histodenz液，在10 ml離心管的底部先小心地鋪4ml 15％的Histodenz，然后將l1％Histodenz細(xì)胞懸液小心地鋪在1 5％的Histodenz液上，上面再小心地滴加一層無(wú)血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液。在這一過(guò)程中一定要避免各層液體混合；

12. 兩離心管3 000 r／min離心30 min（4℃），垂直位小心取下離心管，可以看到明顯的細(xì)胞分層，將11％ Histodenz液與15％ Histodenz液交界面間的細(xì)胞仔細(xì)地吸出，用無(wú)血清RPMI 1640液1700 r／min離心5 min（4℃）沖洗2次；

13. 培養(yǎng)：用含體積分?jǐn)?shù)20％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮，移人培養(yǎng)瓶，于37℃、CO₂體積分?jǐn)?shù)為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，計(jì)數(shù)，以1×10⁶個(gè)／ml的濃度接種于新瓶中培養(yǎng)，24 h后洗去未貼壁的細(xì)胞，即可獲得純化的大鼠肝細(xì)胞。