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幾種檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法

閱讀:1066發(fā)布時(shí)間:2017-11-27

    細(xì)胞凋亡過(guò)程中可觀察到系列形態(tài)學(xué)特征和生化特征。早期凋亡信號(hào)的效應(yīng)產(chǎn)生于胞內(nèi),此時(shí)細(xì)胞膜保持完整?,F(xiàn)已發(fā)展出幾種方法以檢測(cè)凋亡細(xì)胞胞內(nèi)的多種效應(yīng),包括:DNA *段的檢測(cè)、膜對(duì)稱性的變化、caspases 激活、以及細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白水平的變化等。多數(shù)檢測(cè)使用的底物和Marker 適用于絕大多數(shù)種類的哺乳動(dòng)物。

    凋亡細(xì)胞染色體DNA 以核小體為單位的切割導(dǎo)致細(xì)胞不可逆死亡。可以采用Nucleosome ELISA,對(duì)產(chǎn)生的單體及寡聚核DNA *段進(jìn)行定量。核小體的DNA 成分被捕獲于酶標(biāo)板上,使用*標(biāo)記的抗組蛋白抗體檢測(cè)捕獲的核小體數(shù)量。組蛋白-DNA *段的量反應(yīng)了一個(gè)特定樣品中死亡及瀕臨死亡的細(xì)胞的量。

    DNA *段也可通過(guò)片段末端標(biāo)記進(jìn)行原位檢測(cè),DNA *段末端標(biāo)記可通過(guò)熒光染料或比色底物方法進(jìn)行檢測(cè)。另外,細(xì)胞形態(tài)的變化如胞膜皺摺或出泡、核染色質(zhì)致密、胞質(zhì)濃縮等,都可作為細(xì)胞凋亡的證據(jù)。采用熒光染料進(jìn)行末端標(biāo)記的可用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行定量,其光散射變化也可支持由單一參數(shù)得出的結(jié)論。DNA *段可以從凋亡細(xì)胞中分離(Suicide TrackTM DNA ladder Isolation Kit, )并使用瓊脂糖電泳進(jìn)行分析。約180bp 的多倍寡核小體片段在電泳上呈典型的梯狀條帶,可進(jìn)一步證實(shí)凋亡的存在。若使用Pellet Paint Co-Precipitant,只需室溫操作,兩分鐘即幫助DNA 沉淀更快捷方便。

    線粒體膜電位和膜通透性的變化也是凋亡細(xì)胞一個(gè)重要特點(diǎn)??墒褂肅ytochrome c ELISA Kit或Cytochrome c Release Apoptosis Assay Kit試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞線粒體所釋放的*。也可使用Cytosol/Mitochondria Fractionation Kit分離凋亡細(xì)胞線粒體,其膜電位可通過(guò)MitoCaptureTM Apoptosis Detection Kit檢測(cè)。凋亡細(xì)胞另一個(gè)生化特征是細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰*從胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞外。膜聯(lián)蛋白中的Annexin Ⅴ,是一種磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰*有強(qiáng)親和力。通過(guò)使用Annexin Ⅴ-FITC或 Annexin Ⅴ-Biotin ,Apoptosis Detection Kit ,及RAPIDTM 方法進(jìn)行凋亡細(xì)胞早期檢測(cè)??墒褂昧魇郊?xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)。同時(shí)使用PI,根據(jù)細(xì)胞膜的通透性區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

    凋亡過(guò)程中細(xì)胞核同樣發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化。接收到凋亡信號(hào)后,核基質(zhì)蛋白(NMPs)釋放。NMP 的釋放與細(xì)胞死亡相,MERCK 的Cell Death Detection(NMP) ELISA可定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NMP 水平變化。此種檢測(cè)方法優(yōu)于其它方法的原因在于可以直接檢測(cè)組織培養(yǎng)基中NMPs 的水平,而不需細(xì)胞總裂解物,從而避免了細(xì)胞計(jì)數(shù)和樣品準(zhǔn)備等操作。除了結(jié)構(gòu)變化,凋亡細(xì)胞*水平會(huì)降低,可通過(guò)Glutathione Apoptosis Assay Kit進(jìn)行檢測(cè)。

    凋亡可被系列環(huán)境危害、發(fā)育信號(hào)等誘導(dǎo)產(chǎn)生,免疫耐受的誘導(dǎo)和保持,涉及細(xì)胞表面受體的參與。Fas(APO-1, CD95) 是主要的死亡受體,在多種細(xì)胞中引發(fā)凋亡過(guò)程。Fas 配體(FasL/CD95L)與Fas 結(jié)合,激活的Fas 進(jìn)而激活包含caspase 在內(nèi)的幾種效應(yīng)蛋白。FAS/APO-1 ELISA Kit可以檢測(cè)細(xì)胞抽提物、組織培養(yǎng)物、血清中Fas 的水平。同樣,F(xiàn)as Ligand ELISA 可定量檢測(cè)上述各種形式樣品中的膜結(jié)合FasL 和可溶性FasL。兩種檢測(cè)試劑盒都具有很好的靈敏度和度。另外兩種ELISA 試劑盒都提供96 孔板形式,適于高通量篩選。

    Caspases 參與Fas 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的情況現(xiàn)已闡明。Caspase-8 和caspase-9 啟動(dòng)效應(yīng)因子caspase-3 ,后者切割細(xì)胞內(nèi)含有特定識(shí)別序列的底物。針對(duì)caspases 的活性檢測(cè),通過(guò)對(duì)特定底物的切割、釋放出熒光產(chǎn)物。同時(shí)提供陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、特異的caspase 抑制劑以輔助解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外caspase-3 、caspase-8  和caspase-9 活性檢測(cè)試劑盒都提供高通量形式幫助篩選鑒定觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)的因子。


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