ELISA雙抗體夾心法的原理是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量。下面我們就來(lái)看一下elisa試劑盒雙抗夾心法的具體實(shí)驗(yàn)步驟：
首先*步是包被，用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過(guò)夜。第二天，丟棄孔中的溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次洗滌3分鐘。
第二步是加樣，加一定稀釋的待檢樣品0.1ml到已包被的反應(yīng)孔中，置于37℃ 的溫度下孵育1小時(shí)。孵育完之后洗滌。
洗滌完之后需要做的是加酶標(biāo)抗體在各個(gè)反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。
做完上個(gè)步驟，下面我們需要做的就是加底物液顯色，在各個(gè)反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。
實(shí)驗(yàn)即將完成即終止反應(yīng)，于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
實(shí)驗(yàn)的zui后一步即實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定，可在白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。
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