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閱讀:506發(fā)布時間:2015-4-20
血小板衍生生長因子是貯存于血小板α顆粒中的一種堿性蛋白質(zhì)。是低分子量促細(xì)胞分裂素。
1.AG1523細(xì)胞生長在含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)液中。檢測前用0.25%*消化生長到匯合的細(xì)胞。每個35mm培養(yǎng)皿加入2ml含3×104細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液,在37℃ 5% CO2飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。洗去培養(yǎng)液,加2ml無血清的MCDB105培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)2天。
2.第6天時每個培養(yǎng)皿中約含有105細(xì)胞,洗去培養(yǎng)液。加入系列稀釋的待測樣品、0.1mg/ml人血清白蛋白、0.02μCi [3H]脫氧胸苷和無血清的MCDB105培養(yǎng)液,總量1ml。繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
3.吸去培養(yǎng)液,用3~4ml 5%三氯醋酸溶液固定細(xì)胞10分鐘。吸去三氯醋酸溶液,用自來水輕輕洗去固定液,室溫中自然干燥。
4.每個培養(yǎng)皿加入0.5ml含1% SDS的0.3mol/L NaOH溶液,室溫中溶液細(xì)胞15分鐘。將溶解物轉(zhuǎn)移到液體閃爍計(jì)數(shù)管中,加5ml閃爍液,在液體閃爍計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)放射性活性。約3ng/mlPDGF即能誘導(dǎo)50%zui大[3H]脫氧胸苷攝入。
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