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閱讀:230發(fā)布時間:2015-5-22
"交叉呈遞"是免疫學中一個重要的概念。受到抗原刺激的抗原呈遞細胞(Antigen Presenting Cell, APC),主要是樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)能夠將抗原物質分解,然后與MHC分子進行裝配,zui后將該抗原-MHC復合體表達于細胞表面。特定的抗原-MHC復合體能夠與T細胞表面的TCR進行相互作用,并配合輔助分子的相互作用達到激活T細胞的目的。其中,MHC-I-抗原復合體能夠激活CD8+T細胞,而HMC-II-抗原復合體能夠激活CD4+T細胞。經典的MHC-I抗原呈遞依賴于胞漿中的抗原,而"交叉呈遞"為MHC-I對胞外抗原的識別提供的路徑。
"交叉呈遞"主要由DC實現。它能夠介導非DC感染的病原體的呈遞,并激活CD8+T細胞。盡管這一概念十分成熟,然而精細的分子機制卻尚待研究。
目前對于交叉呈遞的機制有兩種假說:1. 液泡通路。該假說認為外界的病原體分子通過內吞的作用進入胞內體中,并接受溶酶體蛋白酶切割碎片化,之后抗原物質在胞內體中與回收的MHC-I分子進行裝配并再次釋放至細胞表面;2. 胞內體-胞漿通路。切割后的抗原物質通過膜上的通道從胞內體中釋放至胞漿中,之后被胞漿中的蛋白酶切割碎片化,zui終與經典的MHC-I通路合流。目前學者普遍認為第二種假說是主要的裝配方式。
對于胞內體-胞漿通路來說,zui重要的步驟是抗原從胞內體中釋放到胞漿外。之前的研究通過利用外毒素A抑制"內質網相關蛋白降解元件(ERAD)"達到了抑制交叉呈遞的作用,因此,一些重要的此類蛋白,包括Sec61與Derlin-1,被認為參與了交叉呈遞的這一關鍵步驟。然而這一說法缺乏直接的證據支持。
首先,作者重復了前人的結果:他們用小鼠BMDC(骨髓來源的DC)與OVA抗原共同孵育,之后加入外毒素A處理(或不處理),之后將處理過的DC與OT-I或OT-II進行共培養(yǎng),并檢測后續(xù)的T細胞的激活情況(IL-2的表達)。結果顯示,外毒素的處理能夠明顯抑制OT-I的激活,但OT-II的激活并不受影響。這一結果一方面說明DC存在交叉呈遞的效應,另一方面了說明外毒素的處理特異性抑制了交叉呈遞的過程。
之后,作者利用電轉的方法將OVA-mRNA與GFP-mRNA轉入BMDC內部進行胞內表達。之后將處理過的DC與OT-I進行孵育。結果顯示,電轉后的DC也能夠刺激OT-I的激活,然而這一效應不再能夠被外毒素A所抑制。之后作者通過流式與WB的結果證明了外毒素A能夠抑制MHC-I -OVA復合體的形成以及胞漿中OVA的量。這一結果說明一旦成熟的抗原物質進入胞漿中,外毒素A的抑制效應就得到了解除。
外毒素A已知能夠抑制多種ERAD的活性,包括Sec61與Derlin-1。首先,作者通過shRNA的方式敲低了Derlin-1的表達水平,結果顯示這一方法并不能夠抑制交叉呈遞效應。之后,作者將目光轉移到了另外一種蛋白Sec61身上。Sec61具有兩個成員,Sec61a1與Sec61a2。通過RT-PCR分析,作者發(fā)現BMDC中Sec61a1的表達量要高于Sec61a2。另外,通過電轉siRNA的方法將BMDC中Sec61a1的水平降低后作者發(fā)現BMDC交叉呈遞的效應得到了顯著的降低。而如果同時直接在胞漿中導入OVA-mRNA則這一抑制效應得到了解除,另外直接利用OT-I特異性抗原多肽刺激也不會受到Sec61a1敲低帶來的負面影響。這說明Sec61a1通過調節(jié)抗原從胞內體中的釋放來達到交叉呈遞的目的。
之后,作者通過電鏡的手段證明了Sec61a1存在于胞內體膜表面的事實。
為了進一步證明Sec61a1的生理功能。作者通過噬菌體表面展示技術篩選到了特異性識別Sec61a1的抗體(scFv片段),并找到了一類可以特異性抑制Sec61a1向胞內體募集的scFv。
之后,作者通過慢病毒轉染的方式向BMDC中導入了該特異性scFv的質粒,并重復了以上實驗。熒光成像結果顯示,該scFv能夠與Sec61a1很好地共定位,同時該scFv能夠明顯抑制胞漿中OVA的含量以及成熟MHC-I 抗原復合體的含量。zui終的激活實驗也表明該scFv能夠抑制交叉呈遞效應。
zui后,他們利用TRIF-/-小鼠的DC發(fā)現TRIF蛋白也參與了這一交叉呈遞的過程。
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