快速牛乳孕酮酶聯(lián)免疫測(cè)定基于自由孕酮和辣根過氧化物酶標(biāo)記孕酮競(jìng)爭與吸附在微滴反應(yīng)板孔壁上的孕酮抗體結(jié)合，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，ABTS底物溶液反應(yīng)1小時(shí)，加反應(yīng)終止液后測(cè)410nm吸收值。當(dāng)特異性抗體量一定時(shí)，且小于被測(cè)和標(biāo)記抗原時(shí)，未標(biāo)記抗原濃度越高，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到按捺，顯色愈淺。敏捷度為5.2pg/孔，批內(nèi)變異系數(shù)為9.06％，批間變異系數(shù)為12.9％。結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶，在碰到相應(yīng)酶底物時(shí)，經(jīng)催化水解及氧化還原等反應(yīng)，形成有色產(chǎn)物。
通過對(duì)乳汁中孕酮含量的測(cè)定，了解酶聯(lián)免疫吸附分析法的基本原理與檢測(cè)技術(shù)。顯色的深淺與酶量呈正相關(guān)，而與樣品中抗原含量呈負(fù)相關(guān)。與RIA法相似，利用被測(cè)抗原與酶標(biāo)記抗原對(duì)特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭結(jié)合，測(cè)試(加入的)標(biāo)記在抗原上的酶催化底物所產(chǎn)生的顏色反應(yīng)。這些酶標(biāo)記物仍保持其免疫性和酶活性，再與相應(yīng)的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物。酶聯(lián)免疫吸附分析法是通過化學(xué)的方法將酶與抗原或抗體結(jié)合，形成酶標(biāo)記物。
制作酶標(biāo)孕酮稀釋曲線及選擇酶標(biāo)孕酮工作濃度以初選的抗血清稀釋度包被酶標(biāo)板，將酶標(biāo)孕酮稀釋成不同濃度，繪出酶標(biāo)孕酮稀釋曲線，選擇斜率zui大并有一定光密度值的稀釋度為工作濃度。酶標(biāo)板的預(yù)處理新制的酶標(biāo)板含有有機(jī)成分，使用前先用無水乙醇浸泡二小時(shí)以上，再用蒸餾水沖刷干凈，37℃烘干或陰干。制作孕酮抗血清稀釋度曲線及選擇孕酮抗血清工作濃度將孕酮抗血清稀釋成不同濃度，包被統(tǒng)一酶標(biāo)板的不同孔眼后，測(cè)其光密度，其目的選擇zui適抗血清稀釋工作濃度。跟著抗血清濃度的下降，光密度也隨之下降，一般初選光密度值為1.0左右時(shí)的稀釋度為孕酮抗血清的工作濃度。制作酶標(biāo)孕酮稀釋曲線及選擇酶標(biāo)孕酮工作濃度以初選的抗血清稀釋度包被酶標(biāo)板，將酶標(biāo)孕酮稀釋成不同濃度，繪出酶標(biāo)孕酮稀釋曲線，選擇斜率zui大并有一定光密度值的稀釋度為工作濃度。
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