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組織內(nèi)蛋白氧化（羰基化；carbonyl）比色法測定試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
組織內(nèi)蛋白氧化（羰基化；carbonyl）比色法測定試劑是一種旨在通過蛋白質(zhì)羰基與聯(lián)胺反應(yīng)，
產(chǎn)生蛋白質(zhì)腙復(fù)合物后峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中羰基含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技
術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）樣品蛋白質(zhì)羰基的
含量檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
蛋白質(zhì)氧化是由于活性氧直接誘導(dǎo)或氧化應(yīng)激產(chǎn)物間接誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子的共價修飾（covalent
modification），其中包括體外氧化劑，以及衰老、疾病所致。氧化還原循環(huán)中的陽離子，例如亞鐵離子或銅
離子，可以與蛋白分子陽離子結(jié)合位點結(jié)合，一旦受到過氧化氫或氧分子的攻擊，致使蛋白分子上脯氨酸
（proline）、精氨酸（arginine）、賴氨酸（lysine）、蘇氨酸（threonine）、組氨酸（histidine）轉(zhuǎn)化為羰基衍
生物（carbonyl derivatives）。羰基是由碳原子和氧原子雙鍵構(gòu)成的功能性基團。蛋白質(zhì)羰基衍生物化學(xué)性能
穩(wěn)定，其羰基化含量成為zui普遍的氧化應(yīng)激活性氧的指標，更是蛋白質(zhì)氧化的標志?；诘鞍踪|(zhì)羰基與2,4-
聯(lián)胺（2,4-dinitrophenylhydrazine；DNPH）反應(yīng)，形成希夫堿，產(chǎn)生蛋白質(zhì)腙復(fù)合物（proteinhydrazone），
在分光光度儀顯示吸光峰值的變化（370nm波長），來定量測定羰基含量。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
Protein carbonyls + DNPH → protein- hydrazone
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
去干擾液（Reagent C） 毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 瓶
陰性液（Reagent E） 毫升
沉淀液（Reagent F） 毫升
凈化液（Reagent G） 毫升
處理液（Reagent H） 毫升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存去干擾液（Reagent C）和反應(yīng)液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent
D）避免光照；陰性液（Reagent E）、沉淀液（Reagent F）和處理液（Reagent H）具有腐蝕性，注意操作
安全；凈化液（Reagent G）具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋；有效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于樣品操作的容器
2 毫升離心管：用于樣品反應(yīng)的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
DOUNCE 勻漿器：用于裂解組織
微型臺式離心機：用于萃取反應(yīng)產(chǎn)物
渦旋震蕩儀：用于混勻反應(yīng)
96 孔板：用于比色的容器
酶標儀：用于比色分析
實驗步驟
一、樣品準備
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定200 毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 移入到一個液氮凍存管
5． 即刻放進液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進一個15 毫升錐形離心管
8． 加入預(yù)冷的xx 毫升裂解液（Reagent B）
9． 強力渦旋震蕩30 秒，充分混勻
10．放進DOUNCE 勻漿器里勻漿80 下
11．將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管
12．放進4℃微型臺式離心機離心15 分鐘，速度為10000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13．小心移取800 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管
14．加入xx 微升去干擾液（Reagent C），混勻
15．室溫下孵育15 分鐘
16．放進4℃微型臺式離心機離心10 分鐘，速度為6000g
17．小心移取上清液到新的1.5 毫升離心管
18．移取10 微升進行蛋白定量檢測
19．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作（注意：建議在1 月之內(nèi)完成檢測）
二、樣品檢測
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent D）取出，加入xx 毫升陰性液（Reagent E），
混勻，標記為反應(yīng)工作液，置入冰槽里備用，避免光照。然后進行下列操作。
1． 準備好待測樣品（例如組織裂解萃取液樣品等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好分光光度儀：波長370nm，并置零
3． 準備2 個2 毫升離心管，標記為背景管和樣品管
4． 分別移取200 微升待測樣品到背景管和樣品管
5． 加入xx 微升反應(yīng)工作液到樣品管
6． 加入xx 微升陰性液（Reagent E）到背景管
7． 分別渦旋震蕩15 秒
8． 室溫下孵育60 分鐘，每隔15 分鐘渦旋震蕩15 秒，避免光照
9． 分別加入xx 毫升沉淀液（Reagent F）
10．分別渦旋震蕩15 秒
11．置于冰槽里孵育5 分鐘
12．放進微型臺式離心機離心15 分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
13．分別小心抽去上清液
14．分別加入xx 毫升凈化液（Reagent G）
15．分別渦旋震蕩15 秒
16．放進微型臺式離心機離心10 分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
17．分別小心抽去上清液
18．分別加入xx 微升處理液（Reagent H）
19．分別渦旋震蕩15 秒
20．放進微型臺式離心機離心10 分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
21．分別移取250 微升上清液到96 孔板里的測試孔
22．即刻放進酶標儀檢測：獲得背景讀數(shù)和樣品讀數(shù)
23．實際吸光讀數(shù)：樣品管讀數(shù)－背景管讀數(shù)
24．計算樣品含量：
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20 次操作
2． 操作時，須戴手套
3． 陰性液（Reagent E）、沉淀液（Reagent F）和處理液（Reagent H）具有腐蝕性，注意操作安全
4． 凈化液（Reagent G）具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋
5． 每次檢測，需進行樣品背景測定
6． 反應(yīng)工作液配制后，可以在4℃保存，但需在1 周內(nèi)用完；避免-20℃保存
7． 如果酶活性過低，可以增加反應(yīng)時間至2 小時
8． 建議待測樣本蛋白濃度為1 至10 毫克/毫升
9． 本公司提供系列氧化檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感