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上海哈靈生物科技有限公司
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酵母質(zhì)粒小量抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)
2014-12-12 閱讀(635)
| 提 供 商 | 上海哈靈生物科技有限公司 | 資料大小 | 221.4KB |
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使用說(shuō)明：
1. 取培養(yǎng)過(guò)夜的酵母1.5毫升，5000g離心1分鐘收集酵母沉淀，棄上清。再重復(fù)一次，每管共收集3毫升培養(yǎng)過(guò)夜的酵母。
再在離心機(jī)快速離心一下(5000g離心1-2秒)，用移液器小心吸盡殘余液體。
通常酵母宜30°C培養(yǎng)過(guò)夜(16-24小時(shí)左右)。建議5000g(~5000-6000rpm)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)
間。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或離心速度過(guò)快會(huì)使沉淀過(guò)于緊密，不利于后續(xù)加入溶液I后充分重懸沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5毫
升酵母液并重復(fù)上述的離心操作，然后直接倒掉上清，再在離心機(jī)快速離心一下(5000g 1-2秒)，用移液器小心吸盡殘余液
體。殘余液體必須吸盡，否則可能會(huì)干擾后續(xù)的酶解反應(yīng)。如果酵母密度明顯偏低，可考慮使用更多酵母液，再重復(fù)上
述操作1-2次。所用酵母量一般不宜超過(guò)5ml。過(guò)量的酵母會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的酶解和堿裂解不充分。
2. 每管加入100微升酶解緩沖液，重懸酵母沉淀。確保沉淀*散開(kāi)，無(wú)可見(jiàn)酵母團(tuán)塊。
可以通過(guò)劇烈Vortex來(lái)重懸沉淀。
3. 加入20微升配制好的Lyticase溶液，充分混勻，30℃水平搖床200-250rpm孵育0.5-1小時(shí)。。
注意：根據(jù)酵母菌株和酵母細(xì)胞數(shù)量的不同，酶解的孵育時(shí)間可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。當(dāng)酵母用量較大時(shí)，酶解的孵育時(shí)間需
延長(zhǎng)。孵育時(shí)間延長(zhǎng)到2-3小時(shí)通常不會(huì)對(duì)質(zhì)粒抽提帶來(lái)負(fù)面影響。
4. 1500g (~3000-4000rpm)離心10鐘，棄上清，收集沉淀。
直接倒掉上清，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。也可在直接倒掉上清后再在離心機(jī)內(nèi)甩一下，用移液
器吸盡殘留液體。不同離心機(jī)因離心半價(jià)的不同g和rpm的換算值有所不同。
5. 每管加入250微升溶液I，重懸酵母沉淀。確保沉淀*散開(kāi)，無(wú)可見(jiàn)酵母團(tuán)塊。
確認(rèn)溶液I中已經(jīng)添加了RNase A。由于此時(shí)酵母細(xì)胞壁已經(jīng)去除，重懸操作要溫和，不宜劇烈振蕩，否則會(huì)容易導(dǎo)致基
因組DNA的污染。但同時(shí)必須保證沉淀充分散開(kāi)，即必須確保酵母細(xì)胞充分分散到溶液中。
6. 每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使菌體*裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會(huì)導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致zui終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。遇到有少量團(tuán)塊或
絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時(shí)間不可超過(guò)5分鐘。
7. 每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見(jiàn)白色絮狀物產(chǎn)生。
切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過(guò)多，否則易導(dǎo)致zui終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。
8. zui高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。
離心后會(huì)產(chǎn)生白色沉淀。離心時(shí)準(zhǔn)備好下一步需使用的質(zhì)粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標(biāo)記。
9. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。zui高速離心30-60秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。
10. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750微升溶液IV，zui高速離心30-60秒，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。
11. zui高速再離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇*揮發(fā)。
注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能*去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。
12. 將質(zhì)粒純化柱置于1.5毫升離心管上，加入50微升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。
溶液V 需要直接加至管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液 V 沾在管壁上，一定要震動(dòng)管子，使液體滑
落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或 MiliQ 級(jí)純水替代溶液V，但是水的pH 應(yīng)不小于6.5。溶液V 加入后
放置時(shí)間稍長(zhǎng)，對(duì)于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會(huì)略有幫助。
13. zui高速離心1分鐘，所得液體即為高純度酵母質(zhì)粒。
