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上海哈靈生物科技有限公司
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冰凍切片線粒體內(nèi)膜功能（膜電位）熒光測定試劑盒產(chǎn)品操作手冊
2019-12-31 閱讀(834)
冰凍切片線粒體內(nèi)膜功能（膜電位）熒光測定試劑盒產(chǎn)品說明書
主要用途
冰凍切片線粒體內(nèi)膜功能（膜電位）熒光測定試劑是一種旨在通過高度敏感的陽離子熒光羰花青染料結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體膜電位的變化，即內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低，來分析冰凍組織樣品線粒體內(nèi)膜功能的完整性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種冰凍動物組織線粒體的功能檢測。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號傳遞、衰老等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，操作極為簡易，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
陽離子熒光羰花青染色劑JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）是一種對膜電位高度敏感的染色劑。它特異性地進(jìn)入線粒體，分布和結(jié)合在線粒體基質(zhì)上。線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。電位高，JC-1形成聚集體，而濃度高，熒光顯色為紅色或桔紅色；反之，則為綠色。熒光減弱表明線粒體內(nèi)膜功能受到損害。
產(chǎn)品內(nèi)容
染色液（Reagent A） 40微升
稀釋液（Reagent B） 5毫升
清理液（Reagent C） 20毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于冰凍切片組織細(xì)胞線粒體熒光定性分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出10微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入890微升稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。
- 準(zhǔn)備5片待測的厚為10微米的未經(jīng)固著處理的冰凍切片
- 置于室溫下，小心加上500微升預(yù)冷的清理液（ Reagent C），鋪滿整個切片表面
- 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
- 小心加上200微升室溫預(yù)熱的染色工作液，鋪滿整個切片表面
- 在37℃濕潤培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意：避免液體蒸發(fā)）
- 小心移去切片上的染色工作液，避免光照
- 小心加上500微升清理液（Reagent C），鋪滿整個切片表面
- 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
- 放上蓋玻片或封片（注意：檢測前置于冰槽里）
- 即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（單濾波或雙濾波）：
觀察紅色熒光：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長590nm或羅丹明（rhodamine）濾波器激發(fā)波長540nm，
散發(fā)波長570nm或德州紅（Texas Red）濾波器激發(fā)波長590nm，散發(fā)波長610nm--可見
亮紅色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞
觀察綠色熒光：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm或熒光素（Fluorescein）濾波器激發(fā)波長490nm，
散發(fā)波長520nm--如果綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明線粒體膜電位受到破壞，未結(jié)合JC
-1染料在細(xì)胞漿里
注意事項(xiàng)
- 本產(chǎn)品為20次操作
- 操作時，須戴手套
- 染色工作液避免光照
- 用戶根據(jù)實(shí)際需求，按比例配制試劑用量
- 根據(jù)不同組織類型，調(diào)整染色工作液的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過度染色
- 建議切片組織染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析
- 孵育時，避免光照
- 雙濾波或雙重測定：健康細(xì)胞和線粒體呈現(xiàn)紅色；死亡或凋亡細(xì)胞及損傷線粒體呈現(xiàn)綠色
- 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品
