質(zhì)譜在糖蛋白研究中的應(yīng)用

   糖蛋白是蛋白質(zhì)中的氨基酸側(cè)鏈被糖基化修飾后的蛋白質(zhì)，廣泛存在于生物體中，具有特殊的生物學(xué)功能。研究糖蛋白的傳統(tǒng)方法一般是將糖鏈切掉并分離純化后再分別進(jìn)行研究。采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）——這一軟電離生物質(zhì)譜技術(shù)，可直接測(cè)定糖蛋白的平均分子量及糖含量，應(yīng)用蛋白酶切及內(nèi)切糖苷酶酶切相結(jié)合的方法，可確定糖基化位點(diǎn)及糖苷鍵類型。
　　一、糖蛋白平均分子量及糖含量的測(cè)定：
　　在糖蛋白MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖上表現(xiàn)為一簇峰，各峰之間約相差一個(gè)或幾個(gè)糖基，同時(shí)還出現(xiàn)多電荷峰，有些樣品中還含少量不帶糖鏈的蛋白峰。糖蛋白的分子量為這些多重峰的平均值。
    從不含糖鏈的蛋白的分子量可以直接得到糖含量，但因其豐度太小難以準(zhǔn)確測(cè)定。采用內(nèi)切糖苷酶F將糖鏈切除，得到含一個(gè)GlcNAc的肽鏈，肽鏈與糖蛋白平均分子量之間的差值即為糖鏈的分子量，糖鏈的分子量與糖蛋白平均分子量的比值即為糖含量。
　　二、糖苷鍵類型及糖基化位點(diǎn)的測(cè)定：
　　糖基化位點(diǎn)的確定，則必須依賴一系列酶切反應(yīng)的實(shí)現(xiàn)來(lái)加以證實(shí)。一般步驟是：①先將糖蛋白還原烷基化、脫鹽，加Glu-c酶切，產(chǎn)物再用內(nèi)切糖苷酶酶切，含糖肽段峰將出現(xiàn)位移。采用差位酶切法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證：內(nèi)切糖苷酶F（Endoglycosidase-F）切斷N-糖鏈中五糖核心區(qū)中,兩個(gè)N-已酰氨基葡萄糖間的內(nèi)糖苷鍵，而糖N肽酶F（PNGase-F）切斷糖鏈與天冬酰氨間的糖肽鍵，兩者相差一個(gè)N-已酰氨基葡萄糖（194Da）；②凝集素對(duì)糖肽的提?。耗厥且活愄墙Y(jié)合蛋白，能專一地識(shí)別某一特定結(jié)構(gòu)的單糖或寡糖中特定的糖基序列并與之結(jié)合。核糖核酸酶B中的糖鏈為高甘露糖型，我們選用其特異性吸附凝集素----伴刀豆球蛋白（ConA）對(duì)含糖肽段進(jìn)行提取，并直接進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，為今后糖肽序列分析及糖鏈結(jié)構(gòu)分析奠定了基質(zhì)譜在糖蛋白研究中的應(yīng)用糖蛋白是蛋白質(zhì)中的氨基酸側(cè)鏈被糖基化修飾后的蛋白質(zhì)，廣泛存在于生物體中，具有特殊的生物學(xué)功能

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