小鼠細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒說明書
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：小鼠細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒
【包裝規(guī)格】50 次/盒
【產(chǎn)品及特點(diǎn)】
本公司開發(fā)小鼠細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列
特點(diǎn)：
1.即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2.引物根據(jù)小鼠細(xì)小病毒專一區(qū)設(shè)計(jì)，特異性高。
3.熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏。
4.一管式閉管操作，降低了交叉污染。
5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
【規(guī)格及成分】
成分 編號 塑料盒包裝
2×qPCR MagicMix 90408 500 μL （棕色管）
熒光 PCR 專用模板稀釋液 180701 1 mL （黃蓋）
小鼠細(xì)小病毒染料法 qPCR 引物混
合液
4yw-8195 100 μL （白蓋）
小鼠細(xì)小病毒染料法 qPCR 陽性對
照(1×10E8 拷貝/μL)
60908-81950
pc
50 μL （黃蓋）
使用手冊 LZ4W-8195 1 份
【運(yùn)輸及保存】
低溫運(yùn)輸、 -20℃保存， 有效期一年。
【自備試劑】
DNA 模板、 超純水、 10×ROX （根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法） 。
【使用方法】
一、 稀釋 PCR 陽性對照 （以 10E2- 10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀
釋度為例）
1.注意： 由于陽性對照濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的
區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分） 。
2.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7， 6， 5， 4， 3， 2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯
槍頭，下同） 。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1
分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上
步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放
冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5
號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。 放冰上
待用。
7.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。 放冰上待用。
二、 樣品 DNA 的制備
8.如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制
備陽性對照），一個是 NC （樣品制備陰性對照）。 可以用 10μL PCR 陽
性對照的 10000 倍稀釋的 （稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL， 10μL
相當(dāng)于 10 萬拷貝，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，
充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自
備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液） 再加上一定量的水作
為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所
用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。制備所得成為樣品
DNA。
9.用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提
取試劑盒兼容。
三、 設(shè)置 qPCR 反應(yīng) （20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管， 其中
N+2 個用于上 步得到的 N+2 個樣品， 1 個用于 PCR 陰性對照， 6 個
用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個
PCR 管， 其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品， 1 個用于 PCR 陰
性對照（用水做模板）， 1 個用于 PCR 陽性對照（用 第 4 號陽性對照
稀釋液， 濃度為 10E4 拷貝/μL） 。下面只描述定量分析的步驟，定性
分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個， 其余不變。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性
對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋
子儲存好后最后加） ：
成分
樣品管
N+2 個
PCR 陰性
對照管
PCR 陽性
對照管
（2-7 管）
2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
小鼠細(xì)小病毒染料法 qPCR 引物混
合液
2 μL 2 μL 各 2 μL
自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 待測樣品 cDNA 模板 6 μL - - 自備超純水 - 6 - 第 7 步所得 PCR 陽性對照 稀釋
液（2-7 號） - - 各 6μL （2
號樣到
2 號管，3
號樣到 3
號管 …）
注:僅 ABI7500、 7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照， 其他熒
光 PCR 儀 器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、
RotorGene3000、 RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用
ROX， 則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR （具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀
器不同而自行優(yōu)化）。
過程 溫度 時間
預(yù)變性 95℃ 5 min
PCR 反應(yīng)
（40 個循環(huán)）
95℃ 15 sec
60℃ 1 min，（采集 SYBR 通道的熒光信號）
按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行熔解曲線分析
四、 數(shù)據(jù)處理
13. 如果把本試劑盒用于定量檢測， 則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸， 以
Ct 值為縱軸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出
樣品 cDNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須
大于或等于 35。 陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線， Ct 值應(yīng)
該小于或等于 30。對待測樣品， 如果其 Ct 大于或等于 35 則為陰性， 如
果小于或等于 30 則為 陽性。如果在 30-35 之間，可結(jié)合熔解曲線判斷，若
樣品的熔解溫度與陽性對照相同，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。 【關(guān)聯(lián)產(chǎn)品】
小鼠細(xì)小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒
