一、熒光素酶的基本特性
熒光素酶（Luciferase）是能夠催化底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱，在自然界中廣泛存在，如螢火蟲、真菌和海洋生物等都能產(chǎn)生熒光素酶。其中，螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）是兩種常用的熒光素酶。
二、熒光素酶檢測的原理
熒光素酶檢測的原理基于熒光素酶催化底物氧化時產(chǎn)生的生物熒光。當(dāng)熒光素酶存在時，它能催化熒光素（或其他底物）氧化成氧化熒光素（或其他氧化產(chǎn)物），并在此過程中釋放出光能，即產(chǎn)生熒光。通過檢測這種熒光，我們可以間接地測量熒光素酶的活性或相關(guān)生物分子的含量。
三、熒光素酶檢測的應(yīng)用
?報告基因測定?：熒光素酶常作為報告基因用于檢測基因表達。通過將熒光素酶基因與待檢測基因的啟動子連接，當(dāng)啟動子被轉(zhuǎn)錄時，熒光素酶基因也會被轉(zhuǎn)錄并表達，從而產(chǎn)生熒光。通過測量熒光強度，我們可以評估啟動子的活性或基因的表達水平。
?啟動子研究?：熒光素酶檢測可用于研究啟動子的強度和活性。通過將熒光素酶基因置于啟動子后面，并測量產(chǎn)生的熒光強度，我們可以判斷啟動子的強弱。
?miRNA研究?：在miRNA研究中，熒光素酶檢測可用于檢測miRNA對目標基因的調(diào)控作用。通過將目標基因的3'UTR與熒光素酶基因連接，并測量熒光強度的變化，我們可以評估m(xù)iRNA對目標基因的抑制作用。
?信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究?：熒光素酶檢測還可用于研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的分子相互作用和信號傳遞過程。
四、熒光素酶檢測的步驟
熒光素酶檢測通常包括以下幾個步驟：
?質(zhì)粒構(gòu)建?：將熒光素酶基因與待檢測基因的啟動子或3'UTR連接，構(gòu)建成報告基因質(zhì)粒。
?細胞轉(zhuǎn)染?：將報告基因質(zhì)粒與實驗細胞共轉(zhuǎn)染。
?細胞培養(yǎng)?：在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)細胞，使熒光素酶基因得以表達。
?細胞裂解?：培養(yǎng)一定時間后，取出培養(yǎng)基并裂解細胞，釋放熒光素酶。
?熒光檢測?：向裂解物中加入熒光素酶底物，并使用熒光測定儀檢測熒光強度。
miRNA通過堿基配對結(jié)合到靶mRNA的3'UTR區(qū),抑制靶基因的翻譯或?qū)Π谢騧RNA的降解達到調(diào)控基因表達的目的。將靶mRNA的3'UTR區(qū)構(gòu)建至螢火蟲熒光素酶報告基因的3'端，與miRNA表達載體及海腎熒光素酶報告基因載體并轉(zhuǎn)染細胞，先后加入兩種底物熒光素，通過對熒光素酶報告基因的表達檢測確認miRNA對靶基因的調(diào)控效果。
熒光素酶檢測技術(shù)應(yīng)用：通過miRNA靶標的鑒定，從而進行miRNA功能的深入研究。
| 實驗問題 | 原因 | 推薦解決方法 |
| 發(fā)光檢測值過低 | 熒光素酶表達過低 | 注意調(diào)整細胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染條件、轉(zhuǎn)染量，提高發(fā)光值 |
| 檢測試劑 | 避免反復(fù)凍融以及保存時間過長 | |
| 發(fā)光檢測值過高 | 熒光素酶表達過高 | 建議通過降低轉(zhuǎn)染量或減少檢測體積等降低發(fā)光 |
